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本论文的研究分两部分。第一部分为多功能纳米材料用于活性氧及光热的肿瘤治疗,第二部分为人LOX家族蛋白的异源表达。本文第一部分主要为多功能纳米材料用于活性氧及光热肿瘤治疗。癌症是影响人类健康的主要疾病之一,近年来,纳米材料和纳米技术应用于肿瘤治疗与诊断成为研究的热点。肿瘤细胞具有一些内在属性,如葡萄糖依赖性、外源性活性氧敏感性及不耐高热。根据肿瘤细胞这些弱点,我们设计了利用葡萄糖氧化酶(GOx)和聚多巴胺(PDA)修饰氧化铁的纳米铁/聚多巴胺/葡萄糖氧化酶纳米材料(Fe3O4@PDA/GOx NPs)。该系统中,多巴胺单体通过自聚形成聚多巴胺,沉积在纳米氧化铁表面,并提供多种活泼基团,作为接枝反应的平台,可共价交联GOx。GOx可以竞争性消耗肿瘤细胞的主要能源物质—葡萄糖,并通过生物化学反应自发地生成活性氧过氧化氢(H2O2)。PDA与纳米氧化铁同为光热转换剂,将近红外光(NIR)的光能转换为热能。此外,该系统利用纳米铁释放的亚铁离子通过芬顿反应(Fenton reaction)催化H2O2转化为毒性更强的羟基自由基(·OH),产生协同效应治疗肿瘤。我们成功合成了具有近红外吸收和光热转换能力的两种尺寸(200 nm和20 nm)的Fe3O4@PDA/GOx NPs,同时该材料可通过消耗葡萄糖产生H2O2。体外结果表明,两种尺寸的Fe3O4@PDA/GOx NPs都可显著抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231生长,但对正常细胞MCF-10A影响较小。其中,200 nm的Fe3O4@PDA/GOx NPs在不施加或者施加近红外光照条件下,对肿瘤细胞的抑制的 IC50 分别为 25.82±1.17 μg/mL 和 20.98±1.06μg/mL,而 20 nm 的Fe3O4@PDA/GOx NPs 在相应条件下分别为 70.56±1.83 μg/mL 和 64.77±1.40μg/mL,分别是200 nm材料的2.7和3倍。使用铁分析试剂盒和普鲁士蓝染色法对与Fe3O4@PDA/GOx NPs孵育后的肿瘤细胞和正常细胞内铁含量进行检测。正常细胞与Fe3O4@PDA/GOx NPs孵育细胞内铁含量基本不变,相比之下,随着Fe3O4@PDA/GOx NPs(200 nm)浓度的升高,肿瘤细胞内的铁的含量依次增加。类似的,对材料处理后的细胞内活性氧含量的研究中发现:当与Fe3O4@PDA/GOx NPs孵育后,肿瘤细胞细胞内及细胞外的H2O2和·OH含量均高于正常细胞,且200 nm较20 nm直径的材料对细胞内外活性氧含量的诱导能力更高。以上实验结果显示,200 nm的Fe3O4@PDA/GOx NPs较20nm的材料,具有更强的肿瘤细胞杀伤能力,这种杀伤能力可能源于其更高的肿瘤细胞亲和能力和更多的细胞外、胞质内的活性氧诱导能力。采用200 nm的Fe3O4@PDA/GOx NPs的材料处理肿瘤细胞,TUNEL染色显示,该材料能够诱导肿瘤细胞的染色体断裂。AnnexinV-FITC/PI双染结果显示,该材料以剂量依赖型和时间依赖型的模式,诱导细胞凋亡。小鼠体内检测结果进一步证实,200 nm的Fe3O4@PDA/GOx NPs在施加近红外光照的条件下,可显著抑制或完全消融小鼠肿瘤,实验组中8只小鼠有5只肿瘤完全消融。此外,Fe3O4@PDA/GOx NPs生物相容性良好,在尾静脉注射条件下,不会对小鼠的主要器官,包括心脏、肝脏、脾脏、肺及肾脏造成明显的损伤。施加材料组的小鼠与注射等体积PBS的对照组小鼠血常规结果无显著差异,体重也没有明显差异。我们的研究可以为发展肿瘤治疗提供一种新思路和新手段。本文第二部分主要为异源表达人赖氨酰氧化酶(lysyl oxidase,LOX,EC 1.4.3.13)家族蛋白。LOX是一种分泌型铜依赖性氧化酶,能氧化伯胺生成活性醛基。LOX蛋白的基本生物学功能是在细胞基质中催化胶原蛋白及弹性蛋白的共价交联,对促进细胞外基质的成熟以及维持其稳定起重要作用。人赖氨酰氧化酶(human lysyl oxidase,hLOX)家族蛋白共有五个成员,包括hLOX和hLOXL1-4。hLOX和hLOXL2是赖氨酰氧化酶家族蛋白的两种典型蛋白结构,他们的C端都含有高度保守的催化活性中心,包括铜离子结合位点、LTQ辅因子、细胞因子受体区域。他们之间的主要差异在于hLOXL2蛋白的N端为4个SRCR域,而hLOX蛋白的N端为前导肽。此外这两种蛋白都有三个预测的N糖基化位点。近年来研究证明hLOX和hLOXL2都参与多种肿瘤细胞的增殖、运动、黏附性、恶性转移、侵袭性及血管生成。在LOX家族蛋白的结构-功能研究中,最大障碍是缺少有效的表达和纯化可溶且有活性的重组蛋白的体系。目前尚未有通过原核表达系统获得大量的重组人赖氨酰氧化酶的报道。为了获得大量可溶的有活性的重组人源LOX家族蛋白,本部分主要利用原核和真核系统表达来源于人的赖氨酰氧化酶家族蛋白hLOX和hLOXL2。本论文尝试将来人源赖氨酰氧化酶(LOX)基因hlox、hloxl2基因分别与助溶标签Trx-tag、GST-tag和亲和标签His-tag、Strep-tag融合表达,并借助DnaK、DnaJ和GrpE、GroEL、GroES两套分子伴侣系统,最终使用融合标签GST-tag在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达并纯化得到可溶的截去信号肽及两个SRCR结构域的hLOXL2的重组蛋白GST-D1-2hLOXL2,并检测到重组蛋白具有LOX活性。此外,本论文也尝试将hlox、hloxl2基因分别在三种毕赤酵母宿主细胞GS115、SMD1168、KM71和两种分泌型表达载体pPIC9K和pPICZαA的组合下分泌表达重组蛋白。其中选用KM71宿主与pPIC9K和pPICZαA载体组合检测到胞内可溶重组蛋白,但表达量较低,无法大量获得。通过原核表达系统表达可溶且有活性的重组人赖氨酰氧化酶,这将对未来进一步研究该家族蛋白的生化性质,以及其在癌症增殖与转移中的作用奠定基础,也可以用于解析其结构,用于开发相关治疗方法和药物。