前言:　　先天性脊柱裂在人群中的发病率为1‰-5‰，中国的发病率要明显的高于西方国家。根据目前研究结果表明，先天性脊柱裂为多基因遗传病，受环境因素和遗传因素共同影响。随着产前诊断技术的发展，越来越多的脊柱裂可以在胎儿期被诊断出来，早期的发现和治疗有利于脊柱裂治疗效果的提高。利用胎儿外科进行宫内脊柱裂修补手术曾给人们带来希望，但是由于只是对缺损皮肤进行修补而未对脊髓的发育异常进行治疗，导致手术的效果不尽如人意。由于缺少有效的治疗方法，许多孕妇都被迫选择中止妊娠。为了使更多家庭免受这样的痛苦，探索更好的治疗方法具有重要意义。组织工程技术的日益发展为我们提供了新的思路，目前有许多疾病可以结合组织工程的方法得到很好的治疗，例如皮肤烧伤，神经损伤，骨缺损等等。脊柱裂可以沿脊柱的任何部位发生，存在脊髓神经、脊椎骨和皮肤的缺损。因此利用组织工程支架和干细胞移植技术可以对多种组织结构的缺损进行修复重建，有望成为有潜在应用前景的治疗方法。　　本文利用骨髓间充质干细胞(BMSCs)做为种子细胞种植于壳聚糖明胶支架上联合培养，通过显微外科宫内移植手术将组织工程复合支架移植在胎龄16天(E16)的先天性显性脊柱裂胎鼠的脊髓缺损区域进行损伤的修复重建，为先天性脊柱裂探索新的治疗方法。　　实验材料与方法:　　一、实验材料与主要仪器　　实验主要材料包括壳聚糖-明胶支架（天津中医药大学提供）、超净台、5％CO2细胞培养箱、离心机、烘干机、水浴箱、天平、倒置显微镜、手术显微镜、荧光显微镜、自动显微照相分析系统、冰冻切片机、流式细胞仪、共聚焦扫描显微镜、青霉素、链霉素、全反式维甲酸、5％水合氯醛、DMEM-F12培养基、胎牛血清、重组腺病毒载体(rAd5F35-mCMV-EGFP)、巢蛋白抗体(nestin)、早期神经元表面特异性标记物微管蛋白(tubulin)　　二、实验方法　　应用全骨髓细胞贴壁筛选法培养骨髓间充质干细胞，将rAd5F35-mCMV-EGFP病毒载体转染至P3代后的骨髓间充质干细胞内，将表达绿色荧光蛋白的骨髓间充质干细胞与壳聚糖明胶支架材料体外联合培养，将联合培养的复合支架材料应用显微宫内手术移植到妊娠第16天的先天性显性脊柱裂胎鼠的脊髓缺损部位，然后在怀孕第20天时取出手术胎鼠并观察其被修复的情况，并用4％的多聚甲醛进行心脏灌注固定，蔗糖梯度脱水，然后进行冰冻连续切片，应用免疫荧光技术检测与壳聚糖明胶支架联合培养的骨髓间充质干细胞在脊髓组织中的存活和分化情况。　　实验结果:　　一、骨髓间充质干细胞(BMSCs)的分离培养及转染　　分离出的骨髓间充质干细胞，原代培养24h后，大部分细胞贴壁生长，2天后第一次换液，可以观察到细胞成簇生长。第4天时可以观察到细胞融合密度可以达到90％以上，并进行传代，其后大概每两天传代一次，P3代以后的BMSCs纯度可以达到90％以上。当细胞融合密度达到60-80％时，将病毒(1.0×1010，1.0×1011和2.5×1011pfu/ml)分别加入到培养基内混匀，再滴入到六孔板内在5％CO2细胞培养箱孵育过夜，第二天换液观察。结果发现浓度为2.5×1011pfu/ml时，BMSCs的状态和转染效率是最好的，可以达到90％以上。　　二、复合支架的制备和特征　　观察到壳聚糖-明胶支架内部孔径均匀一致，并且互相连通，孔径多在300-400μm左右，孔隙率在90％以上，可以为BMSCs提供一个良好的生存空间。将GFP-BMSCs分为1.0×105，2.0×105和5.0×105/mm33种浓度种植在支架上，发现在5.0×105/mm3浓度时，BMSCs可以更充分的在支架内部和表面生长，生长状态良好。　　经过一周的联合培养，对复合支架进行FDA-PI染色，发现支架内部和表面上均有大量的活细胞生长，且生长状态良好。联合培养一周后取材做电镜，电镜观察后发现支架内部有正处于分裂期的细胞，并且分泌大量细胞外基质，伸出伪足，生长状态良好，并且发现支架内部的细胞彼此连接形成网络，攀附于孔壁上。　　三、胚胎手术和复合支架的宫内移植　　本实验在孕鼠妊娠第16天(E16)时对先天性脊柱裂的胎鼠进行复合支架宫内移植手术，共52只孕鼠接受手术，其中一只在E20天之前死亡，另外51只孕鼠在E20天时解剖获得接受手术的胎鼠，累计134只胎鼠接受复合支架移植手术，其中69只成活（成活率为51.5％）。结果发现接受复合支架移植的胎鼠脊髓缺损部位被修复，缺损程度明显缩小，支架内部的BMSCs存活并伴有迁移现象的发生，而迁移部位为组织缺损部位。冰冻连续切片后的结果显示缺损组织被复合支架填充。　　四、复合支架移植体内后的分化情况　　我们根据移植到体内的复合支架上的BMSCs同时表达GFP和Nestin的数量，判断BMSCs分化为神经干细胞的情况;根据同时表达GFP和Tubulin的数量，判断BMSCs分化为神经元的情况。结果发现移植到脊柱裂胎鼠体内后，复合支架上的BMSCs分别向神经干细胞和神经元方向分化，而且聚集性的分化。　　结论:　　1、BMSCs可以在GFP腺病毒转染后，表达绿色荧光蛋白，转染效率可以到达90％以上，而且BMSCs生长状态良好;　　2、GFP-BMSCs可以在壳聚糖明胶支架上有序的分布，生长，且可以在移植体内后成活生长;　　3、进行宫内移植复合支架后的胎鼠可以成活并且脊柱裂的缺损部位有明显缩小的趋势。