目的：肠易激综合征(Irritable bowel syndrome,IBS)作为一种功能性肠道疾病,一直缺乏明确的致病机制阐释及长期有效的治疗药物。中药治疗肠易激综合征以调和肝脾为主,复方或单味药起效机制的研究众多,但对肠道菌群的干预作用研究目前较少。研究表明肠道菌群的改变与IBS发生与发展有着密切联系,中药复方通过口服与胃肠道中的肠道菌群直接接触,因此对肠道菌群的调节作用应当是中药复方发挥治疗作用的重要机制。本研究通过母婴分离方法建立肠易激综合征肠道痛觉高敏大鼠模型,并用调和肝脾复方仁术肠乐(JCM-16021)进行干预,利用PCR-DGGE、illumina测序技术、代谢组学技术及分子生物学技术,研究该中药复方对肠道菌群结构,菌群-宿主共代谢的调节作用,同时观察该复方对宿主肠道中识别微生物变化的toll样受体通路及肠道屏障指标的调节作用,从改善肠道菌群与宿主肠道功能状态两方面,探究该复方改善肠易激综合征肠道痛觉高敏感症状的机制,丰富完善调和肝脾法方药的现代生物学阐释。方法：实验一、母婴分离模型肠道菌群及结肠组织toll样受体改变实验研究1.以母婴分离模拟生命早期应激,将出生后(postnatal Day, PD)14天、35天、56天)实验动物分为6组：PD14-NH、PD14-NMS、PD35-NH、PD35-NMS、PD56-NH、 PD56-NMS,其中NH代表正常无处理大鼠,NMS代表母婴分离大鼠；2.收集出生后各时期各组大鼠粪便样本,利用PCR-DGGE技术观察该模型各时期肠道菌群的改变；3.收集出生后各时期各组大鼠结肠组织,从mRNA水平观察该模型各时期大鼠结肠组织中识别微生物的重要分子toll样受体(TLRs)表达的改变情况。实验二、仁术肠乐干预实验研究1.建立母婴分离IBS大鼠模型；通过结肠扩张及腹壁撤退反射实验确立该模型有腹泻型肠易激综合征所具有的肠道痛觉高敏症状；2.将实验动物随分为正常对照组(NH组)、母婴分离模型组(NMS组)、高剂量中药组(NMS+JCM-H组)、中剂量中药组(NMS+JCM-M组)、低剂量中药组(NMS+JCM-L组)、利福昔明组(NMS+Rifaximin组)：3.予药物干预组仁术肠乐方(由炒白术、酒白芍、厚朴、炒薏苡仁、火炭母、煨诃子、 醋延胡索等七味药组成)或利福昔明灌胃两周,仁术肠乐高、中、低剂量分别为2.42、1.21、0.605 g/kg/天,利福昔明剂量为150mg/kg/天；4.取各组大鼠粪便,提取粪便菌群DNA,运用illumina测序技术分析肠道菌群的具体改变,同时运用代谢组学技术分析粪便代谢产物的改变；5.取各组大鼠近端结肠,运用Western Blot法、免疫组化法等,从蛋白水平检测与所改变的菌群类型及代谢产物种类最为的相关免疫指标toll样受体4 (TLR4)、 MyD88的表达情况,以及肠道屏障指标ZO-1 (zonula occluden-1)、occludin等表达情况。结果：实验一、母婴分离模型肠道菌群及toll样受体改变实验1.PCR-DGGE实验显示,母婴分离模型大鼠在幼年期及成年期均有不同于正常组大鼠的菌群结构,其中出生后(Postnatal day, PD)14天(PD14)时两组(PD14NH、 PD14NMS)群落结构相似度最低,说明出生后14天模型组内肠道菌群发生明显变化。在PD14及PD56两个时期,正常组较模型组细菌种类多,多样性程度高；PD14NH组在各组样品中多样性最高,PD35时两组均呈现多样性及丰度较低的趋势,在PD56时两组大鼠菌群多样性有所上升,但均不如PD14时期；2.各时期的正常对照组与模型组大鼠近、远端结肠TLRs的mRNA表达均有不同程度的差异,其中近端结肠的差异较远端结肠显著,部分亚型在远端结肠的不同时期存在低表达的情况。二、仁术肠乐干预实验研究1.肠道菌群改变结果模型组大鼠菌群丰度(Species richness)较正常组明显降低,显示其物种多样性降低,运用高、中、低剂量的仁术肠乐方干预及利福昔明干预后,各干预组大鼠的肠道菌群多样性菌均显著降低,其中以中药高剂量组及利福昔明组最为明显；模型大鼠具有不同于正常组大鼠的菌群类型,与其他剂量及阳性西药组相比,高剂量中药复方组干预形成的肠道菌群与正常组最为接近；与正常大鼠相比,模型大鼠组菌群改变主要集中在放线菌门、拟杆菌门及硬壁菌门,表现为放线菌门、拟杆菌门增多而硬壁菌门减少。中药及西药干预均对各主要改变的菌群影响显著,高剂量仁术肠乐干预能显著减少模型大鼠的粪便拟杆菌。进一步从分类学水平上总结各组大鼠成年期粪便菌群改变情况发现,与正常大鼠相比,双歧杆菌属(Bifidobacterium)、拟杆菌属(Bacteroides)、紫单胞菌属(Parabacteroides)、普里沃氏菌属(Prevotella)、乳杆菌属(Lactobacillus)、梭菌属(Clostridium)、韦荣球菌属(Veillonella)、Sutterella菌属、Turicibacter菌属、Akkermansia菌属在母婴分离大鼠中增高；而梭菌目(Clostridiales)、毛螺菌科(Lachnospiraceae)、瘤胃菌科(Ruminococcaceae)、Phascolarctobacterium(韦荣球菌科)、脱硫弧菌科(Desulfovibrionaceae)、螺杆菌科(Helicobacteraceae)等在母婴大鼠中减少。利福昔明能够显著逆转母婴分离大鼠出现的双歧杆菌属(Bifidobacterium),类拟杆菌属(Parabacteroides),乳杆菌属(Lactobacillus)及Turicibacter,及Sutterella等菌属的增高,高剂量中药能够有效地减少母婴分离大鼠粪便中普里沃氏菌属(Prevotella)、韦荣球菌属(Veillonella)、梭菌属(Clostridium),消化球菌科的rc4-4,疣微菌科的Akkermansia,同时显著提高母婴分离大鼠粪便中的毛螺菌科的Blautia,韦荣球菌科的Phascolarctobacterium,及脱硫弧菌科的某些未知种属的菌群。其他母婴分离大鼠粪便中与正常组对比有显著差异的菌群属类包括拟杆菌属(Bacteroides),罗氏菌属(Roseburia),瘤胃球菌属(Ruminococcus),颤螺菌属(Oscillospira),螺杆菌属(Helicobacter)及从属于硬壁菌门的Allobaculum菌属等。2.代谢产物改变结果与正常大鼠相比较,母婴分离大鼠粪便中测得的的代谢产物具有显著不同的特征,主要集中在胆汁酸代谢、氨基酸代谢以及脂类代谢的过程中的代谢产物上。利福昔明及仁术肠乐对模型大鼠代谢产物的影响有所差别。母婴分离大鼠粪便中与疼痛相关的胆碱、组胺、花生四烯酸等物质,L-谷氨酸等一系列氨基酸、糖类物质、有机酸、饱和脂肪酸、胆汁酸等较正常组大鼠显著增多；油酸、亚油酸等不饱和脂肪酸等较正常组大鼠减少。仁术肠乐相对于利福昔明对粪便代谢产物起到更广泛的调节作用,其中仁术肠乐能够下调的的代谢产物主要包括花生四烯酸代谢通路中的白三烯等、胆汁酸代谢通路中的各类胆汁酸、乳酸等有机酸、某些氨基酸；仁术肠乐能够上调的代谢产物则包括：脂肪酸合成通路上的油酸、蓖麻酸、亚油酸代谢中的亚油酸等以及色氨酸代谢中的色氨酸等。3.结肠组织免疫及黏膜屏障指标检测结果各组成年期大鼠结肠组织免疫组化结果检测显示,与正常组比较,母婴分离大鼠结肠组织TLR4阳性表达明显增加(P<0.001)。与NMS组比较,中药高剂量组、中药低剂量组、利福昔明组大鼠结肠组织TLR4表达显著降低(P<0.001,P<0.05,P<0.001)；中剂量中药组与NMS模型组相比,TLR4表达无显著差异。肠道粘膜屏障指标ZO-1及occludin在NMS大鼠结肠组织中表达明显减少(P<0.001,P<0.001)。与NMS模型组相比,高剂量、低剂量中药组、利福昔明组大鼠结肠组织ZO-1的表达均显著提高(P<0.05,P<0.01,P<0.001),中药中剂量组无差异。与NMS模型组相比,中药高剂量组、利福昔明组大鼠结肠组织紧密连接蛋白occludin表达显著增高(P<0.001),中、低剂量中药组无差异。各组成年期大鼠结肠组织蛋白电泳结果检测显示,与正常组比较,母婴分离大鼠结肠组织TLR4及MyD88蛋白相对表达量均明显增加,且有统计学意义(P<0.01,P<0.01)。与NMS组比较,各剂量中药及利福昔明干预均能明显降低NMS大鼠结肠组织TLR4蛋白相对表达量(P<0.05),但不能降低MyD88表达量。肠道粘膜屏障指标ZO-1及occludin在NMS大鼠结肠组织中表达与正常大鼠相比明显减少(P<0.01,P<0.01)。与NMS模型组相比,高剂量、低剂量中药组、利福昔明组大鼠近端结肠组织occludin的表达均显著提高(P<0.05,P<0.05),中药中剂量组无差异；所有药物干预组ZO-1表达有升高趋势但无统计学意义。结论：本研究通过在菌群定植的关键时期(出生后两周内)给予母婴分离应激建立IBS肠道痛觉敏感动物模型,以及给予母婴分离模型大鼠中药复方仁术肠乐及利福昔明干预治疗后,明确以下结论：1.母婴分离大鼠在幼年期就已发生肠道菌群结构的显著改变,离乳前的菌群多样性的减少,可能是成年后IBS发生的重要因素；2.成年母婴分离大鼠菌群结构与粪便代谢谱显著改变,主要表现为肠道菌群中拟杆菌门显著增多,硬壁菌门显著减少。菌群中与有机酸、胆汁酸代谢有关的细菌含量和结构发生显著变化。母婴分离大鼠产粪便中糖类、蛋白质、脂类代谢的过程中的代谢产物明显改变,某些有机酸、胆汁酸、氨基酸、嘌呤类物质、饱和脂肪酸增多,不饱和脂肪酸减少,可能与拟杆菌的增多使糖类及蛋白质发酵作用过度、胆汁酸代谢与脂质代谢异常有关；3.综合菌群分析及粪便代谢产物分析结果,提示母婴分离所导致的肠道痛觉高敏与革兰阴性菌拟杆菌门、乳酸菌属、梭菌属等细菌,及与其相关的有机酸、胆汁酸、脂肪酸等代谢产物异常有关。虽然仁术肠乐及利福昔明的干预都能够造成NMS大鼠菌群和代谢产物的改变,但两者干预改变的代谢产物有所不同,利福昔明主要明显减少了粪便中胆碱、组胺、氨基酸、结合胆汁酸的含量。而仁术肠乐对宿主粪便代谢产物的影响更为广泛,其中主要包括下调胆汁酸、氨基酸、花生四烯酸通路上某些代谢产物、多胺的含量及糖类、有机酸等,而上调不饱和脂肪酸如油酸、亚油酸合成,甾体类激素合成等。肠道菌群及与其有关的代谢产物的改变,如有机酸、胆汁酸、胆碱、组胺、花生四烯酸代谢产物如前列腺素等小分子物质对激肠黏膜神经末梢的化学刺激可能是造成肠道痛觉高敏的重要原因。4.母婴分离动物模型结肠中各Toll样受体(TLRs)亚型(TLR1～10)在出生后各时期与正常动物相比均有显著变化,TLRs通路的异常反映了宿主可能对肠道微生物及其代谢产物的改变具有高敏感性。5.仁术肠乐复方治疗肠道痛觉高敏症状的可能机制主要包括：(1)能够从不同水平调节肠道菌群结构,降低拟杆菌门的数量,调节双歧杆菌、乳酸杆菌的数量及结构,减少有机酸、胆汁酸等代谢产物生成的相关菌群,从而调节肠道内有机酸、胆汁酸、饱和脂肪酸及不饱和脂肪酸的含量；(2)抑制可能由于革兰阴性拟杆菌及饱和脂肪酸增多等原因引起的TLR4通路激活,调节宿主肠道免疫应答； (3)增强肠上皮屏障功能。本课题研究表明仁术肠乐能够多靶点对肠道微生态环境起到调节作用,从而改善肠易激综合征肠道高敏现象。