酶法转化柚皮苷制备普鲁宁及其生物活性和微胶囊制备

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柚皮苷具有抗病毒、降血脂、抗肿瘤等作用,普鲁宁是柚皮苷的水解产物,具有调节血糖平衡、抑制癌细胞等多种生理功能,同时可以被人体良好吸收,在食品、药品、化妆品行业具有良好的应用前景。为了克服化学法制备普鲁宁的缺点,本文首先对酶法制备水解柚皮苷制备普鲁宁的工艺进行研究,利用柚苷酶水解柚皮苷制备普鲁宁,得到最佳工艺条件并且得到的高纯度的普鲁宁,进而对柚皮苷及其酶解产物普鲁宁和柚皮素的体外抗氧化活性、抑菌活性以及酶抑制活性进行测定,比较柚皮苷及其酶解产物之间的生物活性差异。最后以海藻酸钠和壳聚糖为壁材对柚皮苷、柚皮素、普鲁宁进行了微胶囊化,并对柚皮苷微胶囊在模拟胃液以及模拟小肠液中的缓释性进行了研究。论文的主要研究内容及结果如下:产自棘孢曲霉JMUdb058的柚苷酶经过磷酸氢二钠-氢氧化钠缓冲液(pH 12)处理过后,可以使普鲁宁在柚皮苷水解过程中得到积累。通过对影响柚苷酶催化柚皮苷水解反应的助溶剂、底物浓度、酶用量、反应温度、pH等因素的考察,得到最适酶用量为10 U/mL,底物浓度为0.16%(w/v),pH为4.0,反应温度为50°C。在此条件下酶解90 min,普鲁宁浓度还保持较高浓度而柚皮苷基本转化完全。利用化学萃取和硅胶柱层析法对反应产物进行分离纯化,通过红外光谱法、紫外-可见扫描法和高效液相法定性对比分析确定分离纯化后所得到的物质为普鲁宁,含量达到99%。以柚皮苷以及其酶解产物普鲁宁和柚皮素为考察目标,通过测定其对DPPH自由基、ABTS自由基的清除能力,以及对Fe3+的还原能力,来评价柚皮苷、普鲁宁及柚皮素的体外抗氧化活性。柚皮苷、普鲁宁、柚皮素及BHT对DPPH自由基自由基的IC50为:4.79±0.12 mg/mL,4.09±0.02 mg/mL,18.21±0.25 mg/mL和0.05±0.00mg/mL,对ABTS自由基的IC50为0.57±0.03 mg/mL,1.03±0.06 mg/mL,0.23±0.02 mg/mL和0.12±0.00 mg/mL,对Fe3+的还原能力排序为:BHT>普鲁宁>柚皮苷>柚皮素。然后,通过抑菌圈法测定它们的抑菌活性,抑菌试验结果表明,这三种物质的抑菌能力存在较大差异,柚皮苷、普鲁宁对供试菌均未表现出抑制效果,只有柚皮素对革兰氏阴性菌大肠杆菌表现出抑制作用。最后测定三种物质对α-淀粉酶和胰脂肪酶的抑制活性,在对α-淀粉酶和胰脂肪酶的抑制试验中,柚皮苷、普鲁宁及柚皮素对这两种酶均表现出不同程度的抑制作用,柚皮苷、普鲁宁及柚皮素对α-淀粉酶的IC50分别为10146.46±2633.41 mg/mL、275.37±48.70 mg/mL、18.65±0.58 mg/mL,对胰脂肪酶的IC50分别为:146.90±24.87 mg/mL、1841.09±826.97 mg/mL、24.51±0.61 mg/mL,结果可以看出柚皮素对这两种酶的抑制作用最为明显。以海藻酸钠-壳聚糖为壁材,分别柚皮苷、普鲁宁和柚皮素为芯材,采用锐孔法制备微胶囊。通过对影响柚皮苷微胶囊制备的4个因素进行研究,确定最佳工艺条件为:海藻酸钠浓度为1.5%(芯材与海藻酸钠的质量比为1:2),氯化钙浓度为2%,壳聚糖浓度为0.2%,pH为5.5,在该工艺条件下柚皮苷、普鲁宁与柚皮素的包埋率分别达到了91.0%、90.2%、91.4%。同时又对柚皮苷微胶囊在模拟胃液和模拟小肠液中的释放性能进行研究,结果表明以海藻酸钠-壳聚糖为壁材的微胶囊在模拟胃液和模拟小肠液中都具有良好的缓释效果,在模拟胃液中缓释效果更加明显。
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