[目的]食品安全是民生领域的关键问题,兽药在畜禽疫病防治、促进生长、改善动物性食品感官性状等方面发挥重要作用,然而伴随其不合理使用出现了一系列安全问题,对人体健康和环境都构成威胁,因此,加强兽药残留监管,对于保护环境健康,促进畜禽业有序发展以及维护人群健康都有着重要意义。本研究拟建立简便、灵敏、高效、可靠的多兽药联合检测的高效液相色谱法,对济南市出售的10种动物性食品中的四类兽药[硝基咪唑类(Nitroimidazoles)包括甲硝唑(Metronidazole,MNZ)、替硝唑(Tinidazole,TNZ)、罗硝唑(Ronidazole,RNZ),β-受体激动剂类(β-adrenergic agonists)包括克伦特罗(Clenbuterol,CL)、沙丁胺醇(Salbutamol,STL)、莱克多巴胺(Ractopamine,RAC),苯并咪唑类(Benzimidazoles,BZs)包括噻苯咪唑(Thiabendazole,TBZ)和阿苯达唑(Albendazole,ABZ),己烯雌酚(Diethylstilbestrol,DES)]进行调查分析,了解济南市动物性食品中兽药残留情况。[方法]1建立动物性食品中兽药残留检测方法1.1样品处理将均质后的样品经乙酸铵条件下β-葡萄糖醛苷酶酶解16h,取出调节pH至弱碱性后,用乙腈超声提取,加入无水硫酸镁和氯化钠除水,PSA、C18和GCB联合净化,提取液经浓缩、过滤,高效液相色谱检测。1.2硝基咪唑类、β-受体激动剂类联合检测色谱条件色谱柱:AgiLentC18 柱(250mm×5mm,4.6μm);流动相:乙腈(A)-0.02M磷酸盐缓冲液(pH=6)(B),梯度洗脱[0～2min,20%A～25%A;2～4min,25%A;4～5min,25%～35%A;5～8min,35%A;8～8.1min,35%～50%A;8.1～15min,50%A;15～15.1min,20%A;平衡 6min];检测波长:0～4.70min 为 227nm,4.70～5.24min为 312nm,5.24～6.40min 为 301nm,6.40～7.50min 为 311nm,7.50～9.00min 为225nm,9.00～10.05min 为 246nm;柱温:30℃;流速:1mL/min。1.3苯并咪唑类、己烯雌酚联合检测色谱条件色谱柱:AgiLent C18柱(250mm><5mm,4.6μm);流动相:乙腈:磷酸盐缓冲液(pH=7)=55:45;检测波长:0～4.40min 为 299nm,4.40～5.60min 为 235nm,5.60～11.00min 为 240nm;柱温:30℃;流速:1mL/min。2济南市动物性食品中兽药残留调查分析2.1样品采集方法2017年7月,选取济南市历下区、历城区、市中区、天桥区和槐荫区等5个行政区做为抽样区,在每个区域内利用便利抽样选取相对人口集中的居民区附近的2个超市和2个大型农贸市场作为抽样点。对猪肉,猪肝,猪肾,鸡肉,鸡肝,鸡胗,鸡蛋,牛肉,牛奶和羊肉等10类食物进行采样,共采集297份样品。2.2检测项目本研究拟检测四类9种兽药,分别是甲硝唑(MNZ)、替硝唑(TNZ)、罗硝唑(RNZ)、克伦特罗(CL)、沙丁胺醇(STL)、莱克多巴胺(RAC)、噻苯咪唑(TBZ)、阿苯达唑(ABZ)和己烯雌酚(DES)。2.3样品种类及数量共检测297份样品,其中猪肉47份,猪肝34份,猪肾22份,鸡肉43份,鸡肝9份,鸡胗22份,鸡蛋40份,牛肉34份,牛奶28份,羊肉18份。2.4数据处理用高效液相色谱仪分析并记录相应的色谱峰面积值,通过标准曲线计算样品中各指标含量。将结果与农业部第235号、第1624号和第1682号等公告中规定标准相比,计算相应检出率或超标率。2.5分析评价利用软件SPSS 24.0进行分析,用单因素方差分析比较多组间平均值,再用SNK检验进一步两两比较,用χ2检验比较两组之间的检出率或超标率的差异,以P<0.05认为差异具有统计学意义。[结果]1建立动物性食品中兽药残留检测方法1.1联合检测硝基咪唑类、β-受体激动剂类1.1.1检测波长和保留时间6 种兽药分别在 312nm,311nm,301nm,227nm,225nm,246nm 处有最大吸收峰,峰形良好,彼此分离,保留时间依次为STL(3.98min),MNZ(5.06min),RNZ(5.50min),TNZ(7.08min),RAC(7.85min),CL(10.16min)。1.1.2线性关系MNZ 回归方程为:A=60835.89441C-269.59377,r2=0.99674;TNZ 回归方程为:A=42508.91374C-24.42677,r2=0.99768;RNZ 回归方程为:A=50710.97472C+163.82715,r2=0.99996;STL 回归方程为:A=33661.19294C+309.84815,r2=0.99355;RAC 回归方程为:A=53713.39334C-787.64839,r2=0.99614;CL 回归方程为:A=30993.54125C+655.34738,r2=0.99742,线性范围均为 0.01～1μg/ml。1.1.3加标回收率和精密度三种不同加标浓度的MNZ回收率为69.21%～85.06%,日内精密度为1.74%,日间精密度为1.56%;三种不同加标浓度的TNZ回收率为68.57%～89.10%,日内精密度为2.55%,日间精密度为2.84%;三种不同加标浓度的RNZ回收率为76.02%～92.36%,日内精密度为1.76%,日间精密度为1.98%;三种不同加标浓度的STL回收率为80.80%～101.56%,日内精密度为3.11%,日间精密度为3.37%;三种不同加标浓度的RAC回收率为75.82%～97.07%,日内精密度为4.28%,日间精密度为5.04%;三种不同加标浓度的CL回收率为78.91%～105.24%,日内精密度为3.25%,日间精密度为3.48%。1.1.4检出限在本实验条件下,MNZ、TNZ、STL、RAC、CL检出限分别为1.36μg/kg,1.95μg/kg,1.54μg/kg,2.05μg/kg,1.81μg/kg,1.59μg/kg。1.2联合检测苯并咪唑类、己烯雌酚1.2.1检测波长和保留时间3种兽药分别在299nm,235nm,240nm处有最大吸收峰,峰形良好,彼此分离,保留时间依次为 TBZ(3.707min),ABZ(4.880min),DES(5.913min)。1.2.2线性关系TBZ 回归方程为:A=103923.40262C+112.7958,r2=0.99726;ABZ 回归方程为:A=71192.6097C+459.66975,r2=0.99691;DES 回归方程为:A=82452.80985 C+156.67244,0.99803;线性范围均为 2.5～100ng/mL。1.2.3加标回收率和精密度三种不同加标浓度的TBZ回收率在81.52%～105.31%之间,日内精密度为2.63%,日间精密度为2.54%;三种不同加标浓度的ABZ回收率在77.07%～104.77%之间,日内精密度为3.52%,日间精密度为3.78%;三种不同加标浓度的DES回收率在65.73%～96.22%之间,日内精密度为1.48%,日间精密度为4.19%。1.2.4检出限在本实验条件下,TBZ、ABZ、DES检出限分别为0.42μg/kg,0.70μg/kg,0.72μg/kg。2济南市动物性食品残留调查分析2.1硝基咪唑类残留情况2.1.1 3种硝基咪唑类药物的检出率及检出范围297份样品中,RNZ残留检出率最高为7.41%,检出范围为3.34～423.80μg/kg;MNZ残留检出率为6.73%,检出残留范围在2.95～94.02μg/kg;TNZ残留检出率为2.36%,检出残留范围在1.95～18.83μg/kg。10种动物性食品中不同程度的检出了 MNZ和RNZ,TNZ仅猪肉和鸡肉检出,检出范围在1.95～28.83μg/kg之间。猪类食品中残留MNZ检出数值较高,高于鸡类和牛类食品(P<0.05);肝脏和肾脏样品中检测到的MNZ残留值明显高于其他器官(P<0.05),其中猪肝中MNZ 检出范围为 8.23～152.93μg/kg,猪肾中 MNZ 检出范围为 9.36～194.02μg/kg,猪肝中RNZ检出范围为64.08～423.80μg/kg,检出值明显高于其他器官(P<0.05);羊肉中仅1例样品MNZ检出,但检出数值达到74.78μg/kg;猪肉中RNZ检出范围为 21.63～80.98μg/kg,鸡胗中 RNZ 检出范围为 41.48～145.16μg/kg。2.1.2不同采样点动物性食品硝基咪唑类检测情况全部297份样品中,有158份采自超市,139份采自农贸市场,统计显示超市与农贸市场采样的样品相比,同种食品同一兽药残留检出情况无明显差异;68份采自历下区,60份采自市中区,63份采自历城区,53份采自槐荫区,53份采自天桥区,统计显示济南市五大行政区之间采样的样品相比,同种食品同一兽药残留检出率无明显差异。2.2 β-受体激动剂类残留情况2.2.1 3种β-受体激动剂类药物的检出率及检出范围297份样品中,CL检出率最高为4.04%,检出范围在3.45～337.71μg/kg;STL残留检出率为3.70%,检出残留范围在4.44～3058.85μg/kg;RAC残留检出率为1.35%,检出残留范围在33.65～442.96μg/kg;其中肾中残留STL检出数值明显高于其他器官食品(P<0.05),猪肾仅1例样品检出,检出数值达3058.85μg/kg;肝类食品中CL检出数值明显高于蛋类样品(P<0.05),猪肝中CL检出率高达到11%以上,检出范围为79.67～337.71μg/kg,鸡肝仅1例检出CL,检出数值为139.42μg/kg;牛肉中2例样品CL残留检出,高值达到616.11μg/kg,羊肉中仅1例样品CL残留检出,检出数值也达到105.94μg/kg。但不同动物源性食品之间检出率没有显著差异。2.2.2不同采样点动物性食品β-受体激动剂类检出情况全部297份样品中,有158份采自超市,139份采自农贸市场,统计显示超市与农贸市场采样的样品相比,同种食品同一兽药残留检出情况无明显差异;68份采自历下区,60份采自市中区,63份采自历城区,53份采自槐荫区,53份采自天桥区,统计显示济南市五大行政区之间采样的样品相比,同种食品同一兽药残留检出率无明显差异。2.3苯并咪唑类残留情况2.3.1 2种苯并咪唑类药物的超标率及超标范围297份样品中,ABZ残留超标率为0,TBZ残留超标率为19.19%,超标残留范围为100.86～1493.59μg/kg。其中,羊类TBZ残留超标率为0,明显小于猪类和鸡类食品(P<0.05)。肝、肾、胃等内脏食品的TBZ残留检出率明显高于肌肉、蛋和奶类食品(P<0.05),且肝和肾样品的TBZ残留检出数值明显高于其他种类样品(P<0.05),其中,肝的检出数值又明显高于胃(P<0.05)。猪肝和猪肾中TBZ超标率分别达到44.12%和40.91%;鸡胗TBZ超标率达到50.00%,超标范围为125.93～1368.35μg/kg;鸡肝样品TBZ残留超标率更是达到100%。所有样品中ABZ均未检出超标,但就残留检出数值来看,鸡肉类样品残留之显著高于蛋类食品(P<0.05)。2.3.2不同采样点动物性食品苯并咪唑类超标情况全部297份样品中,有158份采自超市,139份采自农贸市场,统计显示超市与农贸市场采样的样品相比,同种食品同一兽药残留超标情况无明显差异;68份采自历下区,60份采自市中区,63份采自历城区,53份采自槐荫区,53份采自天桥区,统计显示济南市五大行政区之间采样的样品相比,市中区和槐荫区猪肝中TBZ超标率明显低于其他三个行政区,在大多数其他类型食物中,相同兽药残留的超标率没有显著差异。2.4己烯雌酚残留情况2.4.1己烯雌酚药物检出率及检出范围297份样品中,DES总检出率15.15%,其中鸡肝和羊肉DES残留检出率最高,为 33.33%,残留检出范围分别为 24.31～60.73μg/kg 和 3.38～24.08μg/kg。鸡胗DES残留检出范围为29.38～612.74μg/kg,残留检出数值明显高于其他器官食品(P<0.05)。羊类样品的DES检出率33.33%,明显高于鸡类和牛类样品(P<0.05),不同动物食品检出数值比较无显著性差异。2.4.2不同采样点动物性食品己烯雌酚检出情况全部297份样品中,有158份采自超市,139份采自农贸市场,统计显示超市与农贸市场采样的样品相比,同种食品残留检出情况无明显差异;68份采自历下区,60份采自市中区,63份采自历城区,53份采自槐荫区,53份采自天桥区,统计显示济南市五大行政区之间采样的样品相比,同种食品残留检出率无明显差异。[结论]1建立了统一的前处理后同时检测动物性食品中硝基咪唑类和β-受体激动剂类、苯并咪唑类和己烯雌酚药物残留的HPLC方法,操作简便、灵敏高效、重复性好,同时检测成本较低,可有效应对当前动物性食品中兽药残留的检测要求。2济南市售10种动物性食品中,牛奶和鸡蛋中兽药残留检出率较低,且检出值较低;肝、肾、胃等内脏器官中各兽药检出率较高,且检出数值明显偏高。3济南市售动物性食品中,除阿苯达唑没有检出超标外,其他8种药物均有不同程度检出或超标,其中超标率最高的为噻苯咪唑为19.91%,最低的莱克多巴胺为 1.35%。4对比不同采样点检出情况,绝大多数同种食品同一兽药残留检出率无明显差异。5济南市市售动物性食品兽药残留情况并不理想,需要进一步严加检测和监管。