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血管平滑肌细胞(VSMC)表型转化是动脉粥样硬化、高血压和血管成形术后再狭窄等血管重塑性疾病的共同病理生理过程。其中，VSMC表型转化过程中表型标志基因的表达变化和细胞骨架的重构是当前国内外学者研究的热点问题之一。平滑肌22α(SM22α)是近年发现的一种VSMC分化标志物，其表达具有平滑肌组织特异性和细胞表型特异性，该蛋白的确切功能尚不清楚，推测与细胞骨架聚合有关。为了确定SM22α是否与细胞骨架蛋白肌动蛋白(actin)存在相互作用以及二者之间的结合在VSMC骨架重构和表型转化过程中的病理生理学意义，本研究通过重组表达GST-SM22α融合蛋白，制备兔抗SM22α多克隆抗体，用其观察该蛋白在不同表型VSMC中的细胞定位及其与骨架聚合和细胞收缩之间的关系。
1SM22αC端功能域在大肠杆菌中的高效表达及抗体制备构建含SM22αC端功能域(72～201位氨基酸)和GST编码序列的原核表达质粒，诱导E.coli高效表达可溶性GST-SM22α融合蛋白，分离、纯化融合蛋白，制备兔抗SM22α多克隆抗体。结果如下：
1.1pGEX3X-SM22α的构建与鉴定构建GST-SM22α融合蛋白表达质粒，重组质粒经PCR扩增和BamHI/EcoRI双酶切鉴定后，命名为pGEX3X-SM22α。
1.2GST-SM22α融合蛋白的诱导表达pGEX3X-SM22α宿主菌经IPTG诱导后可表达预期分子量的GST-SM22α融合蛋白，该融合蛋白以胞浆可溶性蛋白和包含体两种形式存在。在培养物(OD600=1.5)按1∶50接种于含0.5mmol/LIPTG的LB培养液中，30℃诱导6h的条件下，SM22α蛋白以胞浆可溶性形式存在的比例最高，是GST-SM22α蛋白诱导表达的最佳条件。
1.3GST-SM22α融合蛋白的分离纯化和抗体制备细菌裂解液上清直接经GST亲和层析进行纯化后，每100ml培养物可得到约20mg电泳纯的可溶性GST-SM22α融合蛋白。包含体经洗涤、纯化、溶解后，GST-SM22α融合蛋白纯度可达95％，以此为抗原常规免疫新西兰白兔，制备兔抗SM22α多克隆抗体，对流免疫电泳测定抗体效价为1∶16。Westernblot证实该抗体具有较高的特异性。
2SM22α在VSMC细胞骨架重构中的作用应用蛋白分步提取及Westernblot检测F-actin/G-actin中SM22α的含量变化，GSTpulldown分析、F-actin体外聚合实验和免疫共沉淀检测SM22α与actin的相互作用，免疫荧光染色观察SM22α和actin在VSMC中的定位关系。建立不同代数、密度VSMC去分化/再分化模型，观察收缩蛋白的表达和定位与VSMC骨架重构及收缩能力之间的关系。结果如下：
2.1SM22α的亚细胞定位与actin一致应用免疫双荧光染色分别标记SM22α与F-actin，荧光显微镜下观察二者在VSMC中的分布。血清饥饿72h后，actin聚合成粗大的纤维束，沿VSMC长轴分布，SM22α在细胞中的分布与α-actin具有一致关系，提示SM22α可能通过与actin相互作用而参与VSMC细胞骨架的聚合。
2.2SM22α参与F-actin聚合通过血清饥饿/刺激建立VSMC再分化/去分化模型，蛋白分步提取和Westernblot检测SM22α和actin在细胞中的分布。结果显示，血清饥饿培养的VSMC中，F-actin/G-actin比值略有增加，SM22α在F-actin中的分布比例也呈上升趋势，与F-actin变化具有平行关系；同样，恢复血清刺激后，由于F-actin的解聚，该组分中SM22α含量也明显减少，提示VSMC表型转化过程中纽胞内的SM22α参与细胞骨架F-actin的聚合过程。
2.3SM22α与actin相互作用参与细胞骨架重构为了确定参与细胞骨架聚合的SM22α是否与actin发生物理学上的相互作用，以结合有SM22αC端功能域的GSTSepharose4B为亲和介质对VSMCF-actin组分蛋白进行淘选，Westernblot分析表明，从亲和介质结合物中可以检测到actin的存在，而且在收缩型VSMC中亲和得到的actin明显多于合成型VSMC，这与收缩型VSMC中F-actin比例增加具有相关关系。为了明确SM22αC端功能域是否具有促进F-actin体外交联的作用，将GST-SM22α蛋白纯品与F-actin共孵育，SDS-PAGE和电镜观察均可检测到沉淀中交联的F-actin，表明SM22α可通过C端功能域促进F-actin发生体外交联。为了进一步探明内源性SM22α是否与actin结合，以抗SMα-actin抗体进行免疫沉淀，得到的蛋白A-抗原-抗体三元复合物中可以检测到SM22α的存在，且随着血清饥饿时间的延长，结合在actin上的SM22α明显增多。以上结果表明，SM22α通过与F-actin结合参与VSMC表型转化过程中细胞骨架的重构。
2.4细胞代数影响VSMC骨架重构和SM22α分布我们在研究过程中发现，在细胞传代次数和密度不同的条件下，收缩型VSMC的收缩反应性存在差异。为了进一步明确细胞代数、密度与VSMC的收缩反应性之间的关系及其内在机制，分别将生长至不同密度(30％～50％汇合或超汇合)的3代和8代细胞进行血清饥饿，以收缩反应性及细胞骨架微丝聚合为指标观察VSMC再分化情况。蛋白分步提取和Westernblot检测F-actin组分/G-actin组分中收缩蛋白含量的变化，分析不同代数、密度的细胞收缩反应性及其与F-actin聚合和交联的特征，探讨SM22α在不同actin组分中的分布与细胞骨架重构的关系。结果发现，血清饥饿诱导后，低代数(3代)、高密度(超汇合)的VSMC微丝排列呈极性、粗大、束状平行的应力纤维，兴奋剂诱导的细胞收缩明显增强。蛋白分布提取和Westernblot分析表明，血清饥饿处理可明显诱导actin聚合为F-actin，并伴有SM22α在F-actin中的富集，该效应与细胞的收缩反应性有一致关系，随着细胞传代次数的增多，该效应逐渐减弱；而收缩蛋白SM1-MHC和SM2-MHC在不同actin组分中的分布可能与细胞密度有关。
结论1.成功构建了GST-SM22α融合蛋白大肠杆菌表达系统，获得电泳纯的GST-SM22α融合蛋白，制备了兔抗SM22α多克隆抗体。
2.证实含SM22αCH-C端和CLR结构域肽段具有与F-actin结合和促F-actin交联的活性，SM22α可通过CH-C端和CLR结构域肽段与actin相互作用而参与VSMC细胞骨架重构。
3.细胞传代次数和生长密度通过改变不同收缩蛋白的比例而影响VSMC细胞骨架重构，SM22α通过促进F-actin聚合和应力纤维形成来调节VSMC收缩性。