目的:对中药注射剂中的大分子蛋白质进行检查是严格控制中药注射剂质量、减少中药注射剂不良反应发生的重要手段。现行的2015年版中国药典采用磺基水杨酸比浊法检查中药注射剂中的大分子蛋白质,该方法简单易行、快速直观,但灵敏度低、专属性差,在检查含有增溶性辅料的中药注射剂时易出现假阳性结果。本实验在课题组前期研究的基础上,采用柱切换技术建立二维高效液相色谱法,通过全面优化该方法的实验条件,测试该方法的工作性能,考察该方法对增溶性辅料吐温-80和丙二醇的耐受浓度,实现对中药注射剂中大分子蛋白质的快速准确检查。方法:1.通过对色谱柱类型、流动相种类、流速、柱切换时间等实验条件进行优化,确定阀切换时间,建立二维高效液相色谱体系,并对该体系的性能进行测试。2.对二维高效液相色谱系统进行方法学考察。综合考虑注射剂组方种类以及是否添加增溶性辅料,最终确定了市售的28种45个批次的中药注射剂作为研究对象,利用该方法对所有中药注射剂样品进行检测,将检测结果同药典方法进行比较,从而对市场上中药注射剂产品的质量进行评价。3.通过对人为添加不同浓度吐温-80和丙二醇的样品及标准品溶液进行检查,考察确定该方法对增溶性辅料的耐受程度。结果:1.实验建立了二维高效液相色谱体系,经过实验优化确定了实验条件。第一维预处理色谱条件:色谱柱:Asahipak ODP-50 4E Guard-Columns(4.6× 10mm);流动相:A甲醇,B0.1%磷酸溶液。梯度洗脱:0-2min70%B-70%B,2-12min 70%B-0%B,12-17 min 0%B-70%B,17-20 min 70%B-70%B;检测波长 280 nm;流速1mL/min。第二维分析色谱条件:色谱柱:TSKgel 5000 PWxl(7.8×300 mm,5μm);流动相:0.1mol·L-1硫酸钠和0.1mol·L-1磷酸缓冲盐等体积混合液(含30%甲醇);检测波长280nm;流速:0.8mL·min-1。六通阀切换时间确定为10s-30s。2.二维高效液相色谱法的专属性、线性、重复性、精密度等结果均符合要求。本实验共选择市售28种共45个批次的中药注射剂进行检测,并人为设定了含量限度,检测结果表明所有中药注射剂均合格,此外二维高效液相色谱法可以耐受的吐温-80浓度8%,而相同浓度的丙二醇对方法没有影响,表明大部分的中药注射剂可以利用此方法得以准确检测。结论:本研究针对药典磺基水杨酸比浊法检测中药注射剂中大分子蛋白质易出现假阳性的问题,建立了二维高效液相色谱法,该方法在准确度和灵敏度方面有了较大提高。本研究为中药注射剂中的大分子蛋白检查提供了新方法,为中药注射剂的质量控制提供了实验依据。