金乌贼(Sepia esculenta)是头足类鞘亚纲(Coleoidea)代表种,一年生且终生仅繁殖一次,生殖后快速死亡,属于一次生殖类型。这种在短时间内发生的生殖和死亡现象可以作为研究生殖、衰老和死亡之间错综复杂关系的切入点。衰老的端粒学说(Telomere theory)认为端粒在细胞老化过程中起重要作用,每次细胞分裂都会因DNA聚合酶功能障碍而不能完全复制它们的染色体,端粒DNA序列长度逐渐缩短,最终造成细胞衰老死亡。端粒酶(Telomerase)能延长端粒重复序列,维持染色体稳定,确保细胞复制能力(Wright et al,1995)。TERT(telomerase reverse transcriptase)基因是端粒酶起作用的关键结构和主要调控亚单位,通过逆转录端粒酶RNA模板序列,合成端粒DNA重复序列并添加到染色体末端,从而维持并延长端粒长度。为了探究金乌贼生殖前后至自然死亡过程中TERT基因表达变化规律,本研究从课题组前期获得的金乌贼卵巢转录组数据中筛选出TERT基因,并选取了金乌贼的生长期(Growth Stage,GS)、生殖期产卵期(Spawning Stage,SS)、濒死期(Aging Stage,AS)三个关键生长发育阶段样品,运用qRT-PCR技术分析不同发育阶段、不同组织和不同性别的TERT基因表达规律,为揭示金乌贼生殖与衰老的关系奠定基础。1.为了解金乌贼发育、生殖与衰老调控的分子机制,实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)被广泛用于基因的表达差异分析。但是,目前尚无qRT-PCR数据标准化处理的可靠内参基因。在本研究采用qRT-PCR对金乌贼的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6pd)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、18S核糖体RNA(18S)、肌动蛋白(ACTB)、28S核糖体RNA(28S)、β-微管蛋白基因(TUB)六种内参基因进行了筛选,使用geNorm、Normfinder、Bestkeeper算法验证了六个内参基因的稳定性。结果表明,雌雄性腺与肝脏中最稳定的内参基因是18SrRNA。这些结果为金乌贼发育、生殖与衰老过程中qRT-PCR基因表达分析奠定了基础。2.本研究从金乌贼转录组中筛选出疑似TERT基因序列,通过系统进化和同源序列分析,鉴定该基因为金乌贼TERT基因,序列长度2415bp。采用qRT-PCR技术,检测金乌贼不同发育阶段关键组织的TERT基因相对表达量,分析其时空差异和性别差异。研究结果显示,与产卵期相比,濒死期的心、肝、胰、鳃、性腺、食道上神经团(除去视腺和视叶后的脑组织)等六个组织TERT基因表达量呈现显著下调趋势。据此推测与濒死期的器官组织分裂和增殖能力下降有关。TERT基因在金乌贼不同组织中具有明显的组织特异性,说明金乌贼各组织器官的衰老状态并不一致。本研究结果可为深入研究头足类生殖与衰老等生命过程的端粒酶调控机制提供基础数据。