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Ⅰ型糖尿病(type1diabetes,T1D)是一种器官特异性自身免疫性疾病,其发病机制复杂,但最终结果都是由于T细胞浸润胰岛,导致胰岛β细胞和其他一些相关细胞破坏,造成体内胰岛素缺乏和糖代谢失调。抗原特异性CD8+T淋巴细胞可以识别胰岛β细胞表面由MHC-Ⅰ类分子递呈的自身抗原肽,通过分泌穿孔素和颗粒酶等机制发挥细胞毒作用,从而破坏胰岛β细胞。因此对疾病期间出现的针对一些自身反应性抗原的T细胞的检测意义重大。在已发现的一些自身反应性抗原中Insulin抗原尤其是InsulinB15-23肽被认为是T1D的触发抗原,但是其作用的具体机制尚未阐明。所以,对Insulin特异性CD8+T淋巴细胞监测尤为重要。MHC I tetramer技术是被公认的定量检测CD8+T淋巴细胞的工具。由于传统MHC I四聚体制备流程繁琐,而且低亲和力的InsulinB15-23抗原肽很难与MHC I重链和轻链分子形成稳定的MHC I单体,因此我们试图引入MHC-I单链三聚体技术(single chain trimer,SCT),制备InsB15-23H-2Kd单链三聚体。将InsB15-23抗原肽,轻链β2m和MHC I类分子重链用两个柔性接头(linker)依次连接成一个整体,提高抗原肽与H-2Kd分子的稳定性。同时,为增强抗原肽InsB15-23与抗原结合槽的锚合能力,并增加膜表达SCT的结构稳定性,我们在linkl与H-2Kd近抗原端引入“二硫键”,将SCT分子中重链“肽C末端结合区”的84位酪氨酸突变成半胱氨酸(Y84C),同时在linker1中引入一个半胱氨酸(L2C),使两个半胱氨酸残基间形成一个二硫键,帮助抗原肽更好地与抗原结合槽结合,即dtSCT (disulfide-trap).基于上述原因,我们实验室已经成功制备可溶性InsB15-23H-2Kd-dtSCT单体(以下简称sSCT),用于制备一种新型的四聚体,作为CD8+T淋巴细胞定量检测的工具。在sSCT单体的基础上,我们试图构建能够膜表达的InsB15-23H-2Kd全长SCT融合基因真核表达载体,观察其体内诱生InsB15-23特异性CTL细胞的能力,从而鉴定sSCT是否有正确的立体构象。而为了提高CD8分子与H-2Kd的亲和力,进一步增强膜表达InsB15-23H-2Kd-SCT向特异性T细胞递呈抗原的能力,我们引入了Q115E的突变,构建得到一个真核表达质粒pInsB15-23H-2KdQ115Efl-dtSCT(以下简称mSCT)。用上述质粒免疫四周龄NOD小鼠,分别免疫一次和三次后,流式检测小鼠外周血以及脾脏细胞中CD8、 InsB15-23双阳性T细胞的数量。实验发现免疫三次后NOD小鼠的外周血CD8、InsB15-23抗原肽双阳性T细胞达到5.34%,高于空质粒组和空白对照组免疫NOD小鼠(1.04%和0.69%),免疫三次检测到的特异性CTL频率明显高于免疫一次。同时未能在脾脏中诱导出特异性的CTLs,而这群特异性细胞的靶组织胰岛中检测的结果也仅有1.3%,具体机制还需进一步探讨。实验结果表明在NOD小鼠体内表达的sSCT分子具有正确的立体构像,能够在NOD小鼠体内诱导InsB15-23特异性CTL细胞。我们成功构建了有功能的InsB15-23H-2Kd-dtSCT融合基因,为制备新型H-2Kd-SCT四聚体作为CD8+T淋巴细胞定量检测工具,同时为选择性清除糖尿病模型NOD小鼠体内自身反应性InsB15-23特异性CTL细胞的实验工作奠定了物质基础,并积累了相关研究资料。同时也为其他自身反应性疾病的研究带来一些方法学上的启示。