自然界中,昆虫对化学信号物质的感知主要通过两种化学感受机制：嗅觉和味觉。借助特定的化学感觉机制,昆虫的嗅觉系统能够感知其周围环境中的大量纷繁复杂的化学信息,完成寄主定位、寻找食物配偶、躲避天敌的捕捉、避免有毒物质以及寻找繁殖场所等多种生理行为。阐明昆虫的化学感受机理,可以加深对昆虫与植物、昆虫与昆虫之间相互关系的了解,帮助我们设计新的方法来进行害虫治理。云斑天牛Batocera horsfieldi (Hope)属于鞘翅目天牛科,是一种重要的蛀干害虫,主要以幼虫蛀食树干和成虫补充营方式养危害树木。由于云斑天牛蛀害,导致杨树树势衰弱或全株枯死；同时还造成了杨树材质的损害,造成极大的经济损失。近年来,对云斑天牛的行为学研究比较多,但对云斑天牛嗅觉识别机制的分子机制研究,国内外尚未见报道。为此我们通过分子生物学手段构建cDNA文库并结合批量ESTs测序,对云斑天牛触角功能基因进行了分析。通过对主要的触角气味结合蛋白OBPs和化学感受蛋白CSPs进行基因克隆,分析其在不同组织中的转录表达谱特征,以及对OBP2和CSP2蛋白的表达纯化,初步探讨了其生理功能。主要研究结果如下：1云斑天牛成虫触角cDNA文库的构建通过LD-PCR技术合成全长ds-cDNA,电泳后,对0.3-0.6kb ds-cDNA和0.6-1kbds-cDNA分别割胶回收,连接到pDNR-LIB载体上。对扩增文库分别采用PCR扩增和蓝白斑筛选的方法进行鉴定,本研究构建的云斑天牛0.3-0.6kb cDNA文库滴度为6.4×105cfu/mL,库容量为8.9×105克隆,得重组率94.5%;0.6-1kb cDNA文库滴度为4.1×106cfu/mL,库容量为5.8×106克隆,得重组率93.2%,且序列基本上均为全长,这充分说明两个定向片段大小的文库构建得较好。通过测序,成功得到了有效ESTs序列692条,经拼接后分别得到‘’Contigs"和‘’Singlets"(?)序列分别为79个和323个,其中功能基因246个,同源但无注释功能等的基因34个。从拼接后的BLASTx结果看,包括68条云斑天牛气味结合蛋白及化学感受相关的基因,去除重复的序列,得到了4个Odorant Binding proteins (OBPs)机因,3个Chemosensory Proteins (CSPs)基因,2个Pheromone binding proteins (PBP)基因以及9个Minus-OBP基因,为广泛开展云斑天牛分子生物学研究提供了重要的参考和依据。2云斑天牛气味结合蛋白和化学感受蛋白的克隆及序列分析利用RT-PCR技术克隆得到云斑天牛3个普通气味结合蛋白(GOBP)基因BhorGOBP1、BhorGOBP2及BhorGOBP3,分别编码142、137和125个氨基酸,预测N-末端分别包含20,19和20个氨基酸组成的信号肽序列。这三个基因编码的氨基酸序列和鞘翅目昆虫GOBP的氨基酸序列比对同源性较高(50%左右),但是BhorGOBP1、BhorGOBP2和BhorOBP3的同源性只有12.68%,说明它们属于不同的GOBP类群；同时克隆得到3个化学感受蛋白(CSP)基因BhorCSP1、BhorCSP2及BhorCSP3的ORF全长,分别编码127、130和125个氨基酸,预测N-末端分别包含20、19和20个氨基酸组成的信号肽序列,所得到的3个CSP基因序列已提交到GenBank,其登录号分别为HQ587041, HQ587040和HQ587042。从序列连配的结果我们发现,在CSPs中存在有3个高度保守的区域结构,分别是位于N-端的Motif A区YTTKYDN[V/I][N/D][L/V] DEIL,中心的Motif B区DGKELKXX [I/L]PDAL,和位于C-端的Motif C区KYDP,进一步分析表明,位于第53、110、123位置的芬芳族残基,以及位于第91/92位的(glutamine/lysine)和129/130位的(lysine/tyrosine)均高度保守。3云斑天牛气味结合蛋白和化学感受蛋白的时空表达谱研究依据已克隆得到的云斑天牛Batocera horsfieldi气味结合蛋白OBPs和化学感受蛋白CSPs基因全长序列设计特异引物,利用RT-PCR和Real Time-PCR技术对云斑天牛主要OBPs基因和CSPs基因在云斑天牛成虫的不同组织及羽化后各个发育阶段的转录表达谱进行了研究。基于云斑天牛成虫期RT-PCR的表达谱分析发现,3个OBP基因和3个CSP基因在头部(去除触角)均不表达,而在触角、下颚须、下唇须、翅、足、腹部均有表达。Q-PCR结果显示3个OBP基因在触角中在不同发育阶段的表达量要远高于3个CSP基因；OBPs和CSPs在雄虫不同组织其表达量要高于雌虫(无论交配与否)；在羽化后1-5天以及羽化后30天左右OBPs和CSPs的表达量较高,远高于中间时期的表达量。结果表明BhorCSPs除了嗅觉功能外,可能还在云斑天牛感受外界化合物的过程中发挥着其它重要作用,其在雌雄虫中不同的表达量及不同时期表达量的不同也表明OBPs和CSPs在雄虫寻找配偶及雌虫寻找补充营养寄主及产卵场所的过程中发挥着重要的功能。4云斑天牛气味结合蛋白OBP2和化学感受蛋白CSP2的原核表达纯化成功构建了云斑天牛BhorOBP2和BhorCSPSP2(?)勺原核表达质粒,由于目的蛋白含有二硫键,我们最终选择以pET32a原核表达载体来表达目的蛋白,pET32a融合表达系统含有一个硫氧还蛋白标签(Trx),该标签不仅可以增加蛋白可溶性,而且能够催化二硫键的正确形成,因此非常适合含有二硫键的OBPs(3对)和CSPs(2对)蛋白的表达;同时,我们对pET32a进行了人工改造,将pET32a载体自带的Thrombin酶切位点的识别序列突变掉,然后在目的蛋白基因的起始密码子前面加上一个Thrombin识别序列,同时为了将该序列和目的蛋白保持一定的空间距离,在二者之间还添加了一段Linker序列(GGGGSGGG),最终使切除的标签从分子量和pI均和目的蛋白有一定的差别,利于后续的纯化。通过对温度以及IPTG浓度的优化,我们最终确定了pET32a-BhorOBP2/CSP2的最优的可溶性表达条件：16℃,IPTG浓度0.5mmol/L,诱导过夜。经镍离子亲和层析和Resource S/Q(阳/阴)离子交换柱及Superdex75凝胶柱纯化得到纯的蛋白,为制作多克隆抗体,进行嗅觉蛋白在云斑天牛触角嗅觉感器中的免疫定位和荧光竞争结合实验检测其对不同来源种类的气味化学物质的结合能力奠定了物质基础。