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多聚免疫球蛋白受体是介导多聚免疫球蛋白(包括IgA和少量IgM)通过粘膜上皮细胞的转运的一种Ⅰ型跨膜糖蛋白,其基因已在多种哺乳动物中克隆。本研究通过分子克隆、基因重组技术,在体外将斑马鱼多聚免疫球蛋白受体(zpIgR)蛋白)的部分编码基因zpIgR连接到pET-28a(+)表达载体上,而后转化大肠杆菌BL21(DE3),使其表达外源蛋白zpIgR,进而利用表达的外源蛋白制备抗原,免疫动物,得到抗血清,利用免疫组化的方法确定zpIgR的组织中的定位。本实验首先以斑马鱼内脏为材料,利用Trizol法提取斑马鱼内脏总RNA,用M-MLV逆转录酶进行反转录获得cDNA第一链,并以其为模板利用RT-PCR扩增得到zpIgR蛋白的部分编码基因zpIgR,经EcoRⅠ、BamHⅠ双酶切后将其连接入pET-28a(+)表达载体中,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,并对重组子进行双酶切鉴定、PCR鉴定以及序列测定。重组质粒经双酶切,得到两条片段,片段大小分别对应pET-28a(+)质粒以及PCR扩增产物。重组质粒进一步测序,结果显示的碱基序列与GenBank中电子克隆的碱基序列基本一致。将阳性重组质粒转化大肠杆菌表达菌BL21(DE3),用1mM的IPTG诱导目的蛋白表达,并对蛋白在菌体内的表达形式进行分析。SDS-PAGE结果显示,与对照菌相比,经IPTG诱导后的重组菌在分子量为30.75KDa处有蛋白表达。进一步实验分析表明,在37℃条件下经1mM IPTG诱导4h时蛋白表达量最大,并且表达的蛋白大部分是以包涵体的形式存在的。用2M尿素对包涵体蛋白进行初步洗涤后,经PBS透析、考马斯亮兰蛋白测定试剂盒定量后,用30%的PEG8000浓缩至适当浓度,制备抗原免疫动物,收获抗血清,并利用得到的抗血清进行琼脂双向扩散以及蛋白质印迹。经琼脂双向扩散测得抗血清的效价为1:32;蛋白质印迹的结果显示,在PVDF膜上特异性的显示出了分子量为30.75KDa的蛋白条带。综上所述,利用RT-PCR方法克隆到zpIgR部分编码基因,构建的重组质粒pET-28a(+)/zpIgR能够成功地在大肠杆菌BL21(DE3)中表达出外源蛋白zpIgR,所获得的融合蛋白的大小与预期相同。利用尿素洗涤该融合蛋白制备抗原,免疫动物得到的抗血清的效价为1:32,免疫组化显示zpIgR在斑马鱼肠上皮细胞和粘液细胞中表达。