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第一部分:气管插管和口咽吸入两种方法吸入二乙酰构建闭塞性细支气管炎小鼠模型的比较研究目的:比较不同给药方式吸入二乙酰(Diacetyl,DA)对构建闭塞性细支气管炎(Bronchiolitis Obliterans,BO)小鼠模型的差异,探讨出简单、易于操作、成功率高且稳定的闭塞性细支气管炎小鼠模型。方法:SPF级6～8周C57BL/6雄性小鼠按随机数字表法分为4组:口咽吸入组(Oropharyngeal Aspiration,OPR)、气管插管组(IntratrachealInstillation,ITI))、口咽吸入对照组(OPR-CON)、气管插管对照组(ITI-CON),每组10只。OPR组在初次口咽吸入DA(即400mg/kg,327mg/ml)1次,制作闭塞性细支气管炎小鼠模型,ITI组通过气管插管吸入 DA(400mg/kg,327mg/ml)1 次,OPR-CON 和 ITI-CON分别经口咽和气管插管,给予等量的消毒的蒸馏水代替DA,其余实验条件相同。上述处理后观察至第7天收集标本,分别留取气管及肺组织进行病理学检测和支气管肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluid,BALF)。结果:经肺功能,BALF计数和病理切片验证,采用口咽吸入和气管插管一次性给予DA(400mg/kg,327mg/ml)均可成功制备闭塞性细支气管炎小鼠模型,两种方法给予DA后肺功能显示气道阻力增加(p<0.05),肺组织HE染色显示支气管周围、肺泡和血管周围大量炎症细胞浸润,管腔闭塞等,但OPR组死亡率高达60%,造模成功率仅为20%,肠道HE显示肠道上皮损伤。而ITI组死亡率仅约30%,造模成功率高达60%。OPR-CON组和ITI-CON均未有死亡。结论:通过口咽吸入和气管插管两种方法一次性给予DA(400mg/kg,327mg/ml),都能成功构建闭塞性细支气管炎小鼠模型。但ITI组,小鼠死亡率低,稳定性好,成功率高,值得实验推荐使用。第二部分:脐带间充质干细胞治疗闭塞性细支气管炎样损伤小鼠模型的疗效观察和机制探讨目的:观察人脐带间充质干细胞(HUC-MSCs)对BO小鼠模型的治疗效果,并简要阐明可能的作用机制。方法:SPF级的C57小鼠按随机数字表分为6组(n=8),空白对照组(Control+NaCl);安全对照组(Control+HUC-MSCs);模型组(BO+NaCl);脐带间充质干细胞治疗组(BO+HUC-MSCs),空白培养基治疗对照组(BO+CM),HUC-MSCs条件培养基治疗组(BO+HUC-MSCs-CM)(总量为200ul),DA处理lh后通过尾静脉注射Dil标记的HUC-MSCs追踪其在肺部的定植情况。每一天同一时间段动态观察小鼠的存活情况,呼吸状态及体重变化情况。收集3d及7d的气管及肺组织,分别进行HE染色及masson染色。同时免疫荧光法及WesternBlot检测气管中E-cadherin,CK-5的表达;利用免疫荧光法检测Dil标记的HUC-MSCs在肺和气管中的定植情况。结果:HUC-MSCs 组及 HUC-MSCs-CM 组与 BO+Nacl 组及 BO+CM相比,小鼠的一般情况好转,体重下降趋势明显减缓(P<0.05),死亡率明显降低(P<0.05)。在 BO + HUC-MSCs 和 HUC-MSCs-CM 组中,3和7天时,气管及肺组织中炎症浸润减少,管腔闭塞程度减轻,气道上皮细胞和基底细胞明显修复。气管组织免疫荧光和western blot显示:BO + HUC-MSCs 和 BO+HUC-MSCs-CM 组气道上皮细胞的 E-cadherin、CK-5表达较其它组明显升高(P<0.05)。用Dil标记HUC-MSC,然后追踪其在小鼠气管及肺组织中的分布,发现HUC-MSCs在2d后在气管中消失,4d后肺组织逐渐减少。结论:HUC-MSCs及其条件培养基对BO小鼠模型具有一定的疗效,与其修复气道上皮损伤有关,推测其可能是通过旁分泌途径影响上皮损伤的修复有关。