论文部分内容阅读
目的检测肌源性干细胞(muscle-derived stem cells,MDSCs)向类神经细胞分化过程中Wnt/β-catenin信号途径相关分子表达水平的变化。探讨Wnt/β-catenin信号途径在MDSCs分化过程中的调控作用。方法无菌条件下取大鼠后肢骨骼肌,将肌组织剪碎。三重酶消化肌肉组织,分离的细胞经差速贴壁法获取MDSCs。获取的MDSCs于培养箱中采用生长培养基培养,细胞传代培养至5~10代用于后续实验。实验分三组:对照组采用生长培养基单纯体外培养MDSCs;实验组采用含丙戊酸(valproic acid,VA)的生长培养基体外诱导培养MDSCs;抑制剂组在实验组诱导培养的基础上采用Dickkopf-1(DKK-1)和Frizzled蛋白家族(sFRP)抑制Wnt/β-catenin信号途径。诱导培养4天后,于倒置相差显微镜下观察各组细胞间形态差异。诱导培养1天和4天后,RT-PCR检测诱导分化过程中MDSCs内Wnt3a mRNA表达的变化。同时采用Western blot检测诱导分化过程中MDSCs内GSK-3β、β-catenin蛋白含量的变化。诱导培养4天后采用免疫细胞化学法检测各组细胞神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolase,NSE)和神经原纤维(neurofibril,NF)表达情况。结果酶消化法结合差速贴壁获取的MDSCs原代生长贴壁良好,细胞初为短杆状,体积较小,以后逐渐伸展。经过诱导之后实验组和抑制剂组细胞形态出现了明显的改变,细胞变为双极或多极形态,实验组细胞形态改变更加明显。与对照组相比,实验组和抑制剂组Wnt3a mRNA表达水平增加,实验组同时明显高于抑制剂组。与对照组相比,实验组和抑制剂组β-catenin蛋白表达水平增加,实验组同时明显高于抑制剂组。实验组和抑制剂组GSK-3β蛋白表达水平低于对照组。实验组和抑制剂组NSE和NF免疫细胞化学染色均出现阳性染色细胞。抑制剂组神经细胞特异性标记阳性表达水平明显低于实验组。结论Wnt/β-catenin信号途径参与了MDSCs的神经分化过程,对细胞分化过程起到了正性调控作用。