糖尿病已成为继心血管疾病和肿瘤之后危害人类健康的第三大疾病。目前治疗糖尿病的方法主要是注射胰岛素,但外源性胰岛素不受生理调节,难以维持血糖恒定,也无法防止糖尿病肾病、冠心病、糖尿病眼病等并发症的发生和发展。对已出现严重并发症、药物不能控制的糖尿病患者,采取胰岛移植是比较理想的治疗方法,但因胰岛来源匮乏和存在免疫排斥反应而受阻。骨髓间充质干细胞(BMMSCs)可来源于糖尿病患者,将BMMSCs体外诱导分化为胰岛样细胞,就能够用患者自体细胞治疗糖尿病。本研究旨在分离2～3月龄流产胎儿BMMSCs,用胎猪胰腺提取液配合其他诱导因子体外诱导BMMSCs向胰岛细胞分化,再将分化的胰岛样细胞移植到STZ诱导的糖尿病模型裸鼠体内,治疗糖尿病,为利用患者自体细胞治疗糖尿病打基础。1胎儿骨髓间充质干细胞生物学特性研究胎儿BMMSCs介于胚胎干细胞和成体干细胞之间,尤其是2～3月龄胎儿BMMSCs,最接近胚胎干细胞,可能是比成体BMMSCs更好的种子细胞。本研究采取纵向剪开骨髓腔涮洗细胞和全骨髓培养法分离2～3月龄流产胎儿BMMSCs,采用MTT法筛选体外培养体系并制作生长曲线,采用流式细胞仪和免疫组织化学法鉴定分离细胞的抗原标志,通过核型分析和成瘤实验评估分离细胞的安全性,通过向神经细胞和心肌细胞诱导分化鉴定分离细胞的多能性。结果表明,沿长轴剪开骨髓腔涮洗细胞法是获得2～3月龄人流产胎儿四肢长骨骨髓的实用方法,α-MEM+20%FCS为体外培养2～3月龄人流产胎儿BMMSCs的最佳培养体系。第3代胎儿BMMSCs除表达成体BMMSCs表面抗原标志外,还表达Oct4、SSEA3和SSEA4等胚胎干细胞标志。第6、12和24代细胞在对数增长期的群体倍增时间分别为34、36和40h,且均为二倍体核型、体内移植后不成瘤。而且分离细胞具有很强的向神经细胞和心肌细胞分化潜能。充分证明2～3月龄人流产胎儿BMMSCs不仅容易分离和培养,而且具有部分胚胎干细胞的生物学特性,安全性良好,具有很强的多项分化能力,完全可以作为人类组织工程和再生医学研究的种子细胞。2体外诱导胎儿骨髓间充质干细胞向胰岛细胞分化(1)2～3月龄人流产胎儿BMMSCs,经过高糖溶液驯化培养和4步诱导体系诱导后,形成类圆球形细胞团,酷似朗罕氏(Langerhans)胰岛,平均直径为125.84±53.45μm (70～180μm),每个细胞团有148.6±63.4(n=986)个细胞,成团率达到50.3±9.4%(n=6)。DTZ染色,胰岛样细胞团和部分未成团细胞呈阳性,为深红色。RT-PCR检测,胰岛样细胞表达胰岛素原、葡萄糖转运子-2、胰高血糖素、生长抑素和胰多肽mRNA。免疫组化检测,胰岛素、葡萄糖转运子-2、胰高血糖素、生长抑素和胰多肽均为阳性。放射免疫检测,胰岛样细胞团比未成团细胞胰岛素分泌量高(P<0.01);2×104细胞用5mmol/L葡萄糖PBS溶液刺激30min,胰岛素分泌量为25.99±11.07μIU/ml;10mmol/L葡萄糖PBS溶液刺激30min,胰岛素分泌量为89.95±21.65μIU/ml;20mmol/L葡萄糖PBS溶液刺激30min,胰岛素分泌量为320.66±30.73μIU/ml,均极显著高于对照组(P<0.01),并且胰岛素分泌量对刺激液中的葡萄糖浓度有显著的依赖性(P<0.01)。(2)4步诱导体系中的每一个步骤及其诱导成分都对诱导胎儿BMMSCs向胰岛细胞分化有重要作用。第1步采用含4mmol/Lβ-巯基乙醇的高糖DMEM诱导1h,具有促进BMMSCs向神经和胰腺共同的前体细胞──Nestin阳性细胞转化的作用,若缺少第1步,诱导细胞的胰岛素分泌量降低35%。第2步采用含10ng/mL EGF、bFGF、HGF + 2%B27 + 4%胎猪胰腺提取液的高糖DMEM诱导4～6d,具有促进Nestin阳性细胞增殖、聚集、成团、向胰腺内分泌细胞转化的作用,若缺少第2步,诱导细胞的胰岛素分泌量降低61%。第3步采用含10ng/mL EGF、HGF + 10mmol/L烟碱+ 25μmol/L醋酸锌+ 2%FCS + 4%胎猪胰腺提取液的高糖DMEM诱导4 d,具有诱导Nestin阳性细胞向胰岛细胞进一步分化,促进胰岛样细胞团隆起、变圆和成熟的作用,若缺少第3步,诱导细胞的胰岛素分泌量降低63%。第4步采用含10nmol/L Exendin-4、GLP-1 + 25μmol/L醋酸锌+ 2%FCS + 4%胎猪胰腺提取液的低糖DMEM诱导2 d,主要是促进胰岛内分泌细胞成熟、促进胰岛素合成、修复β细胞对葡萄糖的敏感性,若缺少第4步,诱导细胞的胰岛素分泌量降低47%。诱导成分筛选结果表明,若缺少HGF、胎猪胰腺提取液、bFGF、EGF、醋酸锌、烟碱、exendin-4或GLP-1,胰岛素分泌量均有显著降低(P<0.01)。3胰岛样细胞移植治疗糖尿病将胰岛样细胞用CM-DiI标记后,移植到糖尿病模型裸鼠的右侧睾丸内,在移植1个月后摘除一部分模型裸鼠的移植侧睾丸,观察血糖变化,检测移植细胞是否存在和是否分泌胰岛素,结果如下。(1)制模:对20只裸鼠按50mg/kg(体重)剂量腹腔注射STZ,每天1次,连续5 d;最后一次注射STZ后72 h开始测定空腹血糖,每天1次,连续3 d;3次空腹血糖值均高于18mmol/L者入模。注射STZ后,20只裸鼠中有17只连续3次空腹血糖值均高于18mmol/L,进入试验,其余3只3次空腹血糖值中至少有1次低于18mmol/L,被淘汰。制模成功率为85%(17/20)。(2)标记细胞:分别将CM-DiI工作液加入BMMSCs和胰岛样细胞培养板孔,37℃培养箱内孵育5min,4℃冰箱内孵育15min,PBS洗涤,在100倍显微镜下观察5个视野(荧光镜与相差镜对比计数),每个细胞都带红色荧光,标记率为100%。(3)治疗糖尿病:将17只糖尿病模型裸鼠随机分为三组:试验组(7只)每只右侧睾丸内注射CM-DiI标记的胰岛样细胞约1×105;对照组(5只)每只右侧睾丸内注射CM-DiI标记的BMMSCs约1×105;空白对照组(5只)每只右侧睾丸内注射等量PBS。试验组7只裸鼠在移植胰岛样细胞后两周内高血糖症完全恢复正常,体重稍有增加;1月后摘除其中3只裸鼠的移植侧睾丸,摘除睾丸后裸鼠血糖值又升高到原来水平(>18mmol/L),体重直线下降,并在术后30d内死亡;其余4只裸鼠维持正常血糖水平,恢复健康。两个对照组裸鼠持续高血糖,体重逐渐减轻,在60 d内全部死亡。(4)移植物检测:将摘除的移植侧睾丸制作石蜡切片,在共聚焦荧光显微镜下观察,带红色荧光的移植细胞主要分布于曲细精管周围的睾丸间质区;用胰岛素单抗和FITC标记的绿色荧光二抗进行免疫组化染色后,带绿色荧光的细胞也分布于曲细精管周围的睾丸间质区,这表明移植细胞生产胰岛素。