MicroRNA通过对PPARα的转录后调节参与肝脏脂肪酸代谢

来源 :第四军医大学 | 被引量 : 5次 | 上传用户:fenghaiweiran
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肝脏是机体的重要代谢器官,其代谢活动受激素、酶类、代谢底物及周期节律等多种因素共同调节,并且作为中心枢纽与肌肉、脂肪组织等多个器官进行代谢物质及代谢水平的紧密联系,共同维持机体的运转。伴随机体饱食或饥饿等能量状态,肝脏进行分解或合成代谢等应答,将糖及脂类物质加工分解或合成储存,最终维持机体的能量平衡。饥饿与饱食状态会使机体的能量代谢发生显著的变化。饱食状态下,肝脏中糖原和TAG的合成、转运增加,而饥饿状态下,肝脏的糖原分解、糖异生、脂肪酸氧化和酮体生成增显著加。PPARα高表达于FA代谢旺盛的组织中,如肝脏、骨骼肌、棕色脂肪、心脏及肾脏中,属于PPAR家族成员。PPAR家族是一类配体活化的转录因子,在脂和碳水化合物的代谢调节中发挥了重要作用。根据已有文献报道,PPARα在饥饿状态下的肝脏FAO及酮体生成中发挥重要作用,且饥饿时表达升高。CPT-1α,ACADM是FAO过程中的2种关键限速酶。CPT-1α介导了LCFA-Co A进入线粒体外膜,是FAO的第一步;而ACADM特异性催化C4-C12直链中链FA在线粒体中的β氧化。HMGCS2是催化酮体生成的关键限速酶。而这三种酶同时也是PPARα的直接下游靶基因,其表达均受PPARα转录上调。以往的肝脏能量代谢研究多关注PPARa的翻译后修饰,包括乙酰化、磷酸化、泛素化、糖基化等,但其分子本身表达水平的调节研究较少。本研究从转录后调控水平探讨了micro RNA通过结合于PPARa 3’UTR调节其表达,发现mi R-21,mi R-27a,mi R-106b,mi R-181a可以通过直接调节PPARa,参与饥饿状态下肝脏的脂肪酸代谢。目的:[1]通过小鼠体内模型,检测PPARα及micro RNA在肝脏饥饿状态中的表达变化,筛选潜在调控PPARα的micro RNA;[2]通过细胞模型,探讨micro RNA调控肝细胞脂肪酸代谢的作用;[3]验证micro RNA对PPARα的调控机制;方法及结果:[1]在本研究中,我们首先通过小鼠饥饿及饥饿再进食模型,获取肝组织,发现与正常饮食对照组小鼠相比饥饿24h后小鼠肝组织中出现较多的脂滴堆积,油红O染色呈红色阳性着色。当小鼠饥饿24h再进食24后,肝组织中脂滴,显著减少,趋于正常。通过q RT-PCR的方法检测其内源性PPARα及其下游参与FAO及酮体生成过程的关键限速酶CPT-1α,HMGCS2,ACADM的m RNA表达变化,实验结果与文献一致,随小鼠饥饿,PPARα及其下游基因显著升高,而小鼠再进食后其表达恢复至接近正常水平。而4种候选micro RNA的变化则与之呈负相关,提示,这些micro RNA可能参与了饥饿状态下肝脏中脂肪酸代谢调控。[2]随后我们用4种micro RNA特异性的mimics转染人肝癌细胞系Heg G2,同时进行低糖诱导饥饿模型处理。运用q RT-PCR检测在此模型下PPARα及其下游基因,以及糖异生的限速酶G6Pase的m RNA表达,同时western blot实验检测了PPARα的蛋白表达,发现Hep G2细胞饥饿模型中,200mg/L的低糖处理显著升高以上基因m RNA的表达。而转染针对4种micro RNA的mimics后,其m RNA升高受到显著抑制,且表达趋于正常水平,甚至低于正常对照。western blot与之一致,提示,mi R-21,mi R-27a,mi R-106b,mi R-181a可能是通过调节PPARα参与了饥饿条件下肝细胞的脂肪酸代谢。[3]最后,我们证实了mi R-21,mi R-27a,mi R-106b,mi R-181a的特异性inhibitor可以上调Hep G2细胞中PPARα及其下游基因CPT-1a和ACADM m RNA的表达变化。q RT-PCR结果显示,4种micro RNA的干涉,均可显著上调以上基因的表达,虽然抑制mi R-21的上调效果虽较低,但仍具有统计学意义。另外通过生物信息学预测,发现mi R-21,mi R-27a,mi R-106b,mi R-181a在PPARα3’UTR有潜在结合位点,随后我们克隆了PPARα3’UTR上两段富含micro RNA识别序列的片段,通过荧光素酶报告基因检测系统,证实了4种micro RNA可以通过直接结合于PPARα3’UTR,从而在转录后水平调控PPARα的表达。结论:本研究从转录后调节角度出发,探讨了PPARα在饥饿状态下肝脏脂肪酸代谢中的功能受mi R-21,mi R-27a,mi R-106b,mi R-181a调节。通过q RT-PCR、western blot等方法验证PPARα在饥饿小鼠肝组织中显著上调,且随再进食其表达降低。4种micro RNA的表达则与PPARα呈负相关,且可以通过直接结合于PPARαm RNA3’UTR影响饥饿状态下肝脏的脂肪酸代谢。
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