目的：　　 支气管肺发育不良(BPD)是胎龄小于28周的早产儿最常见和严重的并发症，特别好发于极低出生体重儿。相关报道显示极低出生体重儿（出生体重＜1，500 g）BPD发病率高达43％，大约50％的BPD患儿在儿童早期会因为呼吸窘迫再次入院，特别是发生呼吸道合胞体病毒感染时。BPD患儿常伴有长期的呼吸系统和神经系统发育不良性疾病，可持续致青少年期甚至成年期，严重影响早产儿生存质量，大大的增加了医疗负担。　　 临床研究已证实多种危险因素均可导致早产儿BPD的发生，包括高氧症、机械通气性肺损伤和出生前感染。这些因素以积累和协作的方式引起肺部炎症反应和肺损伤，从而导致肺泡及肺血管发育障碍。目前为止，BPD的发生机制仍不清楚。但大量研究证实，氧化应激在BPD的发生、发展中起到关键性作用。我们先前的研究已证实在高氧致新生鼠BPD的发生过程中存在氧化应激性肺损伤，其它研究也有相关报道。　　 ROS攻击DNA可造成多种类型的氧化性DNA损伤，从而危害细胞正常的活力和生理功能，甚至导致癌症的发生。目前认为，氧化性DNA损伤主要由碱基切除修复(BER)途径修复。在哺乳动物细胞，8-羟基鸟嘌呤 DNA转葡糖基酶1(OGG1)在碱基切除修复途径中发挥重要作用。研究发现，肺动脉内皮细胞过表达OGG1可以减轻黄嘌呤氧化酶诱导的线粒体DNA损伤和细胞凋亡。另有研究显示，转染siRNA到肺动脉内皮细胞致OGG1活性表达显著降低，可使黄嘌呤氧化酶诱导的线粒体DNA损伤修复延迟，同时增加细胞凋亡。　　 研究已发现，OGG1在对抗氧化性DNA损伤中起到重要作用。然而，高氧致新生鼠BPD的发生过程中是否存在肺上皮的DNA损伤，以及该损伤是否与OGG1基因有关？相关研究少有报道。本研究就以上问题展开探索，从而阐明DNA损伤与BPD的关系，试图为BPD的防治寻找新的思路和途径。　　 材料与方法：　　 一、实验模型与分组　　 1、动物模型及分组　　 健康成年Wistar大鼠(250 g)，雌雄交配(4∶1)，雌鼠孕21-23d自然分娩的新生鼠160只，生后12h内(0d)随机分成实验组(高氧组，FiO2=0.9)和对照组（空气组，FiO2=0.21），每组均为80只，雌雄不限。　　 实验组（高氧组）将新生Wistar大鼠（连同母鼠）生后置于氧箱（有机玻璃箱）中，持续输入氧气，氧浓度维持为90％，用测氧仪持续监测（美国OM-25ME），CO2浓度＜0.5％(钠石灰吸收CO2)，温度25～27℃，湿度60％～70％（变色硅胶吸收水蒸气），每24h定时开箱20 min，添加水、饲料及清理氧箱，并与空气组交换母鼠以避免因氧中毒而致代母鼠喂养能力下降。对照组（空气组）置于正常空气环境中，氧浓度为21％，饲养条件及实验控制因素同实验组。　　 二、标本采集及处理　　 每组分别于实验后1，2，3，5，7d随机抽取16只，10％水合氯醛(0.3ml/100 g)腹腔注射麻醉，腹主动脉放血后，分离肺组织，左肺至于4％多聚甲醛中固定，其中8只用于冰冻切片制备（免疫荧光检测肺上皮OGG1蛋白），另8只用于石蜡切片制备（观察肺组织形态学改变），右肺立即置于液氮中，后于-80℃冻存，用于基因及蛋白等检测。　　 三、AECⅡ细胞的分离、纯化、培养及鉴定　　 新生Wistar大鼠经10％水合氯醛(0.3ml/100 g)腹腔麻醉处死，无菌条件下取肺组织，分别采用胰酶和胶原酶消化、分离AECⅡ细胞，分离纯化后的AECⅡ细胞于DMEM培养基中培养，经倒置显微镜、透射电子显微镜及SP-C免疫荧光共聚焦显微镜鉴定后用于实验。　　 四、实验方法及检测指标　　 1、原代培养新生鼠AECⅡ细胞鉴定:(1)倒置显微镜;(2)透射电子显微镜;(3) SP-C免疫荧光共聚焦显微镜。　　 2、HE染色法观察新生鼠肺组织形态学改变。　　 3、竞争ELISA测定新生鼠肺组织和AECⅡ细胞中8-OHdG含量。　　 4、彗星实验检测新生鼠AECⅡ细胞中DNA丝条断裂。　　 5、免疫荧光检测新生鼠肺组织中OGG1蛋白表达及定位。　　 6、Western blot检测新生鼠肺组织和AECⅡ细胞中OGG1蛋白表达。　　 7、real-time PCR检测新生鼠肺组织和AECⅡ细胞中OGG1 mRNA表达。　　 五、统计学分析　　 应用SPSS17.0软件进行统计学分析。组内及组间数据分析采用单因素方差分析(ANOVA)和Bonferroni，显著性检验水平为0.05。　　 实验结果：　　 一、原代培养新生鼠AECⅡ细胞鉴定　　 1、倒置显微镜鉴定　　 呈岛状贴壁生长，细胞圆形、立方形或多边形，胞浆内有反差明显的颗粒。　　 2、透射电子显微镜鉴定　　 胞质内可见AECⅡ细胞特异性结构板层小体，细胞表面有短小微绒毛。　　 3、SP-C免疫荧光共聚焦显微镜鉴定　　 表面活性蛋白C(SP-C)特异表达于AECⅡ细胞，可见红色荧光定位于胞浆。　　 二、HE染色观察新生鼠肺组织形态学　　 空气组:Ⅰd至7d，肺泡结构逐渐规则，肺泡腔大小逐渐均匀，肺泡间隔逐渐变薄。高氧组:1d，与空气1d无明显差别;3d，肺泡间隔变厚，肺间质可见少量中性粒细胞和巨噬细胞浸润;5d，肺泡间隔进一步变厚，肺间质中性粒细胞和巨噬细胞浸润增加，且肺泡腔内可见少量中性粒细胞和巨噬细胞浸润;7d，肺泡上皮结构破坏增加，肺间质和肺泡腔大量炎性细胞浸润，肺泡腔可见纤维蛋白沉淀。　　 三、新生鼠肺组织及AECⅡ细胞中8-OHdG含量　　 1、竞争ELISA测定肺组织中8-OHdG含量　　 与空气组相比:高氧1d，8-OHdG含量无明显差别(p＞0.05);高氧2，3，5，7d，8-OHdG含量显著增加（高氧2d，p＜0.05;高氧3，5，7d,p＜0.01）。总的来说，8-OHdG含量随高氧暴露时间延长而逐渐增加。　　 2、竞争ELISA测定AECⅡ细胞中8-OHdG含量　　 与空气组相比:高氧12，24，48，72h，8-OHdG含量显著增加(高氧12，24，48，72h，P＜0.01)。总的来说，8-OHdG含量随高氧暴露时间延长而逐渐增加。　　 四、高氧暴露诱导新生鼠AECⅡ细胞DNA丝条断裂　　 利用碱性彗星实验检测AECⅡ细胞DNA丝条断裂情况。空气对照组48h，只有极少量的DNA发生迁移;高氧48h，可见DNA从细胞核显著迁移，形成“彗星尾”;彗星尾长和Olive尾矩是国际公认的评估DNA丝条断裂的指标。与空气组相比，高氧暴露组各时间点的尾长(12h,p＜0.05;24，48，72h,p＜0.01)和Olive尾矩(12，24，48，72h，p＜0.01)均显著增加，且随高氧暴露时间延长而逐渐增加。　　 五、新生鼠肺组织及AECⅡ细胞中OGG1蛋白表达及定位　　 1、免疫荧光检测肺组织OGG1蛋白表达及定位　　 空气组1d及3d和高氧组1d，OGG1蛋白主要定位细胞质，且OGG1蛋白表达无明显差异;高氧3d，5d和7d，细胞核和细胞质中OGG1蛋白荧光信号均显著增加，且细胞质增加更明显。高氧3，5d，OGG1蛋白表达最高;高氧7d，OGG1蛋白表达较高氧5d减少，但较高氧1d增多。　　 2、Western blot检测肺组织OGG1蛋白表达　　 在肺组织中，我们检测到分子量大约在47 kDa的优势条带。与空气组相比，高氧1d，OGG1蛋白表达无明显改变(p＞0.05);高氧2，3，5，7d，OGG1蛋白表达显著增加(2，3，5d，p＜0.01;7d，p＞0.05)。总的来说，肺组织OGG1蛋白表达于高氧2d开始升高，高氧3d和5d达高峰，高氧7d开始下降。　　 3、Western blot检测AECⅡ细胞OGG1蛋白表达　　 在AECⅡ细胞中，我们检测到分子量大约在47 kDa的优势条带。与空气组相比，高氧12，24，48h，OGG1蛋白表达显著增加(12h，p＜0.05;24，48h，p＜0.01);高氧72h，OGG1蛋白表达无明显改变(p＞0.05)。总的来说，AECⅡ细胞OGG1蛋白表达于高氧12h开始升高，高氧24h达高峰，高氧48h开始下降，高氧72h进一步下降。　　 六、新生鼠肺组织及AECⅡ细胞OGG1 mRNA表达　　 利用实时荧光定量PCR检测肺组织及AECⅡ细胞中OGG1 mRNA相对表达量。肺组织(p＞0.05)和AECⅡ细胞(p＞0.05) OGG1 mRNA表达在高氧组和空气组各时间点均无明显差异。　　 结论：　　 本研究分别通过体内和体外的高氧暴露实验，证实了在BPD发生早期肺上皮细胞存在氧化性DNA损伤，且随高氧暴露时间的延长而逐渐增加。此外，DNA损伤修复基因OGG1表达上调可能在此过程中发挥重要作用。