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研究背景和目的肺癌已经成为全世界范围内癌症病人死亡最常见原因,其发病率和死亡率在全球恶性肿瘤中居首位。非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)占所有肺癌病例的85%左右,大多数NSCLC患者被发现时已处于局部晚期或晚期,整体五年生存率约为15.6%。近年,以表皮生长因子酪氨酸激酶为靶点的分子靶向药物取代传统的细胞毒性药物在肿瘤治疗中具有划时代的意义。吉非替尼和厄洛替尼作为表皮生长因子受体-酪氨酸激酶抑制剂(epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitors, EGFR-TKIs)的代表,已用于表皮生长因子(epidermal growth factor receptor, EGFR)突变型晚期非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)的一线治疗用药,然而由于耐药现象的出现使得患者使用EGFR-TKIs的中位有效时间仅为8-10个月,了解及克服EGFR-TKIs获得性耐药是晚期NSCLC治疗亟待解决的问题之一。研究证实,NSCLC细胞对EGFR-TKIs获得性耐药的可能机制包括靶基因的二次突变和肿瘤细胞对EGFR信号通路的旁路激活。目前较为肯定的是,EGFR基因的第20外显子T790M突变和c-Met的扩增,两者约占获得性耐药的60%,临床上已开发研究了针对这一耐药机制的药物。目前存在的问题是,仍有40%的获得性耐药机制尚不明确。其中可能包括EGFR外的酪氨酸激酶受体信号传导通路的激活、EGFR下游信号通路中的分子异常活化、蛋白酪氨酸磷酸酶基因(PTEN)的缺失、EML4-ALK融合基因及细胞发生EMT等。上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transitions, EMT)是指在多种因素刺激下,细胞由上皮表型向间质表型转化的一种现象,以E-钙黏蛋白(E-cadherin)、连环蛋白(catenin)等上皮型标志蛋白的减少或缺失以及波形蛋白(vimentin)、纤维粘连蛋白(fibronectin)等间质型标志蛋白表达增多为主要特征。EMT是一种基本的生理病理现象,不仅在多细胞生物胚胎发育与器官形成中、慢性炎症及多种慢性疾病的发生发展过程中起着重要作用,而且存在于肿瘤的发展过程中,与肿瘤的发生、肿瘤细胞的原位侵袭和远处转移均密切相关[12-15]。胰岛素样生长因子Ⅰ型受体(insulin-like growth factor I receptor, IGF-1R)是存在于细胞膜表面的跨膜四倍体,具有酪氨酸激酶活性。IGF-1和IGF-2与受体IGF-1R结合后可激活受体细胞内酪氨酸激酶,使多种蛋白的酪氨酸残基磷酸化,进而激活两条主要的信号通路：PI3K-AKT通路和ERK/MAPK通路,促进有丝分裂及细胞生长。另外,IGF-1R在肿瘤组织中具有高表达,其表达异常与恶性肿瘤的发生密切相关。新近研究显示,EGFR野生型NSCLC细胞对EGFR-TKIs耐药过程中伴随着EMT及IGF-1R蛋白增加,提示EMT和IGF-1R可能与NSCLC对EGFR-TKIs的获得性耐药有关,但两者诱导耐药的细胞学机制尚未阐明。既往基础研究中,获得性耐药过程中发生EMT的同时p-AKT表达增多及p-ERK水平降低,且并不伴有EGFR的激活,表明EMT可能由PI3K/AKT介导。也有研究显示,IGF-1R及其下游信号传导通路的激活不仅可介导对EGFR信号通路的旁路激活过程,同时在许多肿瘤细胞产生EMT的过程中也起了重要作用。因此,我们推测：EMT可能是通过IGF-1R及其下游PI3K/AKT激活诱导NSCLC细胞对EGFR-TKIs产生获得性耐药。因既往基础研究中仅观察了EGFR野生型的A549细胞对EGFR-TKIs获得性耐药过程中EMT的改变,对EGFR突变型NSCLC细胞是否如此,以及是否在EGFR野生型细胞中具有普遍性,尚未见报道。且既往研究仅限观察了EGFR-TKIs获得性耐药中IGF-1R蛋白的表达,对其信号转导通路是否异常尚有待探讨。本研究同时选用EGFR突变型和野生型NSCLC细胞,分别用吉非替尼和厄洛替尼将其诱导成EGFR-TKI s获得性耐药细胞,观察NSCLC细胞在对EGFR-TKI s获得性耐药过程中EMT及IGF-1R、EGFR信号通路相关分子的改变,以期探讨NSLCL对EGFR-TKIs产生获得性耐药的可能机制。方法1、选用EGFR突变型和野生型的人NSCLC细胞PC-9和H460,分别用吉非替尼和厄洛替尼将其诱导成耐药的PC-9/ZD和H460/ER细胞。高分辨率溶解曲线分析技术(Quantitative PCR high-resolution melting,qPCR-HRM)检测H460及PC-9细胞EGFR及Kras基因突变；MTT法检测各组细胞的增殖情况,划痕实验及Transwell侵袭实验检测细胞迁移和侵袭能力,蛋白质印迹法和RT-PCR法分别检测IGF-1R及EGFR信号通路分子及EMT相关分子的蛋白和mRNA表达。2、统计方法采用SPSS13.0软件进统计学分析,结果数据以x±s表示。2组间比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析,组间比较用LSD检验。P<0.05为差异有统计学意义。结果1、PC-9和H460细胞的EGFR和K-ras基因突变状况基因突变检测结果显示,PC-9细胞为EGFR基因第19外显子突变型,H460细胞为EGFR基因野生型；两株细胞均为K-ras基因野生型。2、PC-9/ZD和H460/ER细胞对EGFR-TKIs获得性耐药PC-9、PC-9/ZD、H460和H460/ER细胞均呈无限繁殖,H460和H460/ER细胞第2天进入对数生长期,PC-9和PC-9/ZD细胞第3天进入对数生长期。EGFR-TKIs吉非替尼(0.01～10μmol/L)可抑制PC-9和PC-9/ZD细胞生长,该抑制作用具浓度依赖性；PC-9/ZD细胞对吉非替尼的敏感性较PC-9细胞显著下降,IC50值分别为7.85±1.64和0.04±0.00μmol/L,差异有统计学意义(P<0.05):EGFR-TKIs厄洛替尼(1～100μmol/L)可抑制H460细胞生长,并呈浓度依赖性；H460/ER细胞对厄洛替尼的敏感性较H460细胞显著下降,IC50值分别为57.55±11.04和15.05±1.20μmol/L,差异有统计学意义(P<0.05)。以上结果说明,PC-9/ZD和H460/ER细胞对EGFR-TKIs具有获得耐药性。3、获得耐药性后细胞形态改变与PC-9和H460细胞相比,EGFR-TKIs获得性耐药的PC-9/ZD和H460/ER细胞形态倾向梭型发展,细胞间连接变得更加疏松,符合间质细胞形态学表现。4、获得耐药性后细胞侵袭和转移能力增强划痕实验结果显示,无论是突变型和野生型细胞,诱导成耐药细胞后划痕两边缘距离均明显缩短：PC-9/ZD与PC-9细胞相比距离缩短66%(P<0.05),H460/ER与H460细胞相比缩短44%(P<0.05)。侵袭实验结果显示,耐药细胞穿过Matrigel胶的细胞数明显高于原亲本细胞：PC-9/ZD细胞穿过Matrigel胶的细胞数为PC-9细胞的1.82倍(P<0.05),H460/ER细胞穿过Matrige1胶的细胞数为H460细胞的3.34倍(P<0.05)。以上结果说明,突变型和野生型细胞诱导成耐药细胞后,细胞侵袭和转移能力均明显增强。5、获得耐药性后细胞EMT标志分子表达变化RT-PCR和蛋白质印迹法检测耐药细胞和亲本细胞中EMT标志分子E-Cadherin和Vimentin从基因到蛋白水平的表达差异,结果显示,无论是野生型还是突变型细胞,获得耐药性后细胞中间质标志Vimentin mRNA和蛋白表达量均明显增加(P<0.05)；与PC-9细胞相比,突变型耐药的PC-9/ZD细胞表皮标志E-Cadherin mRNA及蛋白表达量均减少(P<0.05),而在野生型H460和H460/ER细胞中均未检测到E-Cadherin表达。另外,野生型H460细胞的获得性耐药过程中,Vimentin蛋白表达增多呈时间依赖性。6、获得耐药性后细胞EGFR和IGF-1R信号蛋白表达变化蛋白质印迹法检测结果显示,无论是突变型和野生型细胞,获得耐药性后IGF-1R蛋白及其磷酸化水平表达量均明显增加(P<0.05),同时磷酸化AKT和ERK表达水平提高(P<0.05),而EGFR表达未见明显变化(P>0.05)。另外,PC-9/ZD细胞的EGFR磷酸化水平与PC-9细胞相比未见明显差异,而H460/ER细胞的EGFR磷酸化水平较H460细胞显著下降(P<0.05)。RT-PCR检测结果显示,在mRNA水平上,获得性耐药细胞与原亲本细胞相比,各分子的基因表达量均未见明显差异(P>0.05)。结论本研究发现：1、NSCLC细胞H460为EGFR野生型细胞,PC-9为EGFR突变型细胞；H460/ER和PC-9/ZD分别为H460和PC-9对EGFR-TKIs获得性耐药细胞株。2、EMT及IGF-1R信号转导通路均可能在NSCLC的EGFR-TKI获得性耐药中起重要作用,而且NSCLC细胞IGF-1R及其下游PI3K/AKT和ERK/MAPK信号通路的激活可能通过诱导EMT导致对EGFR-TKIs获得性耐药。