恶性胸膜间皮瘤(Malignant Pleural Mesothelioma,MPM)是一种源自胸膜间皮细胞的恶性侵袭性肿瘤,通常与石棉暴露有关,从石棉暴露到间皮瘤形成的潜伏期大约是40年。石棉由于价格低廉,曾被广泛用作防火、绝缘以及保温材料,长期石棉暴露所导致的恶性间皮瘤在欧美等发达国家受到了高度的重视,2005年起欧盟就已全面禁止一切石棉的使用,但间皮瘤的发病率一直在增加,据估计,直到2020年左右,大多数工业化国家的MPM死亡率每年将以5-10%的速度增长。中国是温石棉的生产和使用大国,石棉安全以及由其诱发的恶性胸膜间皮瘤问题亟待引起重视。恶性胸膜间皮瘤患者预后差,采用单一治疗方法疗效不理想,联合手术、放疗、化疗可改善患者症状,延长生存时间,标准的一线化疗方案是铂类药物联合培美曲塞,但化疗疗程短,部分患者治疗效果不佳。肿瘤细胞抵抗细胞毒性药物引起的细胞凋亡是化疗失败的主要原因。因此,研究恶性胸膜间皮瘤中抗凋亡的相关通路和机制、寻找抑制抗凋亡通路的相关药物是提高化疗成功率的重要方向。从姜科植物根茎中提取的姜黄素,是一种天然植物源性多酚类化合物,能够在多种恶性肿瘤的治疗中发挥作用,研究表明其抗肿瘤机制主要是通过作用于多个靶点,诱导肿瘤细胞凋亡。细胞凋亡可以通过外源性途径以及内源性途径诱导发生,外源性凋亡途径由细胞外死亡信号与细胞表面的凋亡受体作用介导,主要激活细胞内Caspase级联反应;内源性凋亡途径是由细胞内信号引发线粒体膜通透性改变并多种凋亡因子释放,诱导细胞凋亡。凋亡的中心事件是Caspase的激活以及线粒体膜通透性改变,凋亡相关因子与多种信号通路在细胞内形成异常复杂并且互相影响的网络,调控凋亡的发生。在过去的30年里,PI3K/Akt/mTOR作为受体酪氨酸激酶下游通路,在维持细胞蛋白质合成、存活、生长、转移、抵抗凋亡以及血管生成等多个方面发挥重要作用,已经成为肿瘤学中重要通路之一。PI3K/Akt/mTOR通路内的突变经常发生的位置包括抑制基因PTEN和TSC1/2,以及癌基因PIK3CA、PIK3R1和Akt。PI3K/Akt/mTOR通路由于致癌基因突变以及肿瘤抑制因子失活导致通路功能异常活化,通过药物阻断或抑制该通路功能,是众多临床试验的目标。既往有研究发现姜黄素能够通过抑制PI3K/Akt/mTOR通路发挥抗肿瘤作用,另有研究发现恶性胸膜间皮瘤标本中PI3K/Akt/mTOR通路处于活跃状态,有关姜黄素治疗MPM的研究报道较少,其作用机制、相关信号通路仍有待进一步完善。第一部分姜黄素对恶性胸膜间皮瘤RN5细胞增殖及凋亡的影响。目的:通过体内外实验探讨姜黄素对恶性胸膜间皮瘤RN5细胞增殖以及凋亡的作用。实验方法:1.将RN5细胞与不同浓度姜黄素、顺铂溶液孵育72小时后,用SRB方法分析细胞存活率,计算半数效应浓度(EC50)。2.将RN5细胞接种在6孔板中,设置阴性对照DMSO组、不同浓度姜黄素组以及阳性对照顺铂组,药物孵育细胞24小时后,流式细胞术检测姜黄素对细胞周期及凋亡的影响。3.建立RN5细胞荷瘤小鼠模型,移植瘤最大径达到6mm时,将小鼠随机分成4组:溶剂对照组,低剂量姜黄素组,高剂量姜黄素组以及顺铂组,每5天给予腹腔内注射药物,定期测量肿瘤大小并计算肿瘤体积,同时记录小鼠体重,待对照组肿瘤最大径达到15mm时处死小鼠,收集肿瘤标本并记录重量,评估姜黄素对小鼠体内移植瘤生长的作用。4.荷瘤小鼠肿瘤标本福尔马林固定石蜡包埋,组织切片,进行CD31和Ki67的免疫组织化学染色,并使用末端缺口原位标记(TUNEL)方法对肿瘤标本染色,显微镜下观察染色结果,通过半定量分析,评估姜黄素对移植瘤细胞增殖、凋亡以及血管生成的作用。结果:1.梯度浓度姜黄素以及顺铂作用RN5细胞后,细胞的增殖受到不同程度的抑制,并且药物的作用在一定范围内呈现剂量依赖性。通过绘制细胞增殖曲线,求得姜黄素在72小时的半数效应浓度EC50值为19.1±1.3μM,而顺铂的半数效应浓度EC50值为7.09±1.14μlM。2.细胞周期实验结果表明,姜黄素以及顺铂作用RN5细胞24小时后,处于G2/M期的细胞比例增多,对比阴性对照DMSO存在统计学差异;凋亡实验结果表明,姜黄素以及顺铂作用之后,RN5细胞早期及晚期凋亡比例增多,对比阴性对照组具有统计学差异。3.小鼠接种RN5细胞之后成瘤良好,姜黄素和顺铂组注射药物5次之后,肿瘤体积小于对照组,其中顺铂组和高剂量姜黄素组肿瘤体积明显低于对照组;处死动物后剥取肿瘤并称重,顺铂和姜黄素组肿瘤重量低于对照组,其中顺铂和高剂量姜黄素组肿瘤重量较对照组明显降低;实验结束时姜黄素组的小鼠体重较对照组差异不明显,而顺铂组小鼠体重明显低于对照组。4.肿瘤标本的Ki67免疫组化结果显示,姜黄素组和顺铂组肿瘤Ki67表达阳性细胞比例减少,采取H评分法进行半定量评估,顺铂组和高剂量姜黄素组肿瘤标本Ki67染色H评分明显低于对照组;TUNEL实验显示姜黄素组和顺铂组肿瘤阳性染色细胞比例增多,其中高剂量姜黄素组和顺铂组的TUNEL染色H评分明显高于对照组;CD31结果显示姜黄素组和顺铂组阳性染色面积减少,其中高剂量姜黄素组CD31阳性染色面积明显低于对照组。结论:1.姜黄素能够抑制恶性胸膜间皮瘤RN5细胞的增殖。2.姜黄素在可以体外诱导RN5细胞G2/M期细胞阻滞,并能诱导细胞凋亡。3.姜黄素在小鼠体内可以抑制移植肿瘤的生长,且毒性作用不明显。4.姜黄素在动物体内能够抑制肿瘤细胞增殖,诱导细胞凋亡,并发挥抗血管生成作用。第二部分姜黄素诱导RN5细胞凋亡的机制研究。目的:探讨凋亡相关因子以及PI3K/Akt/mTOR信号通路在姜黄素诱导恶性胸膜间皮瘤RN5细胞凋亡过程中的作用。实验方法:1.将RN5细胞接种于培养皿,设置阴性对照DMSO组、不同浓度姜黄素组以及阳性对照顺铂组,不同药物孵育细胞24小时后,使用蛋白印迹法(Western blot)检测凋亡相关蛋白:Caspase-3/cleaved Caspase-3、Caspase-8/cleaved Caspase-8、Caspase-9/cleaved Caspase-9、Bax、Bcl-xL、cleaved PARP 的细胞内水平,评估内源性以及外源性凋亡途径在姜黄素诱导RN5细胞凋亡中的作用。2.通过Western blot检测凋亡诱导因子AIF在细胞核内的蛋白水平,并利用免疫荧光观察AIF核转位情况,探讨AIF在姜黄素诱导RN5细胞凋亡中的作用。3.将RN5细胞接种于培养皿,设置阴性对照DMSO组以及不同浓度姜黄素组,药物孵育细胞24小时后,通过Western blot检测PI3K/Akt/mTOR通路相关蛋白 PI3K、Akt/p-Akt、mTOR/p-mTOR 以及 p70S6K/p-p70S6K 的细胞内水平,评估该通路在姜黄素诱导RN5细胞凋亡中的作用。4.将RN5细胞接种于培养皿,分别使用PI3K、Akt、mTOR抑制剂预处理2小时后,再给予姜黄素孵育24小时,通过Western blot检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-xL、cleaved PARP 以及 PI3K/p-PI3K、Akt/p-Akt、mTOR/p-mTOR 的细胞内水平,以期判断姜黄素作用PI3K/Akt/mTOR通路的可能靶点。结果:1.不同浓度姜黄素孵育RN5细胞之后,各组细胞内Caspase-3表达无明显变化,顺铂组作用之后cleaved Caspase-3蛋白水平升高,姜黄素组及阴性对照DMSO 组均未能检测到明显 cleaved Caspase-3;各组 Caspase-8、Caspase-9 表达大致相近,姜黄素组以及顺铂组均未能检测到明显的cleaved Caspase-8、cleaved Caspase-9 片段。姜黄素作用之后,RN5细胞内cleaved-PARP的水平升高,促凋亡蛋白Bax水平升高,而凋亡抑制蛋白Bcl-xL水平降低,对比阴性对照DMSO组,姜黄素各组cleaved-PARP、Bax、Bcl-xL蛋白水平变化具有统计学差异。2.不同浓度姜黄素作用之后RN5细胞核内AIF蛋白水平升高,对比阴性对照DMSO组,AIF水平升高具有统计学差异。免疫荧光法检测AIF核转位情况,结果提示AIF在细胞核内的免疫荧光强度随着姜黄素浓度的升高而增加;阴性对照DMSO组AIF 阳性免疫荧光主要聚集在细胞质内。3.不同浓度姜黄素孵育RN5细胞之后,姜黄素组细胞内PI3K、p-Akt、p-mTOR和p-p70S6K蛋白水平下调,对比阴性对照DMSO组,相关蛋白水平降低具有统计学差异;而Akt、mTOR、p70S6K表达水平无明显变化。4.分别使用PI3K抑制剂LY294002,Akt抑制剂MK 2206,以及mTOR的抑制剂Rapamycin预处理RN5细胞之后再次使用姜黄素孵育,结果发现LY294002和Rapamycin作用于RN5细胞后,没有对PI3K/Akt/mTOR信号通路蛋白及凋亡相关蛋白表达产生显著影响;Akt抑制剂MK 2206作用于RN5细胞后,p-Akt表达水平显著升高,并干扰了姜黄素对Bax、cleaved-PARP、Bcl-xL的作用。结论:1.姜黄素在RN5细胞内能够通过不依赖于Caspase,由AIF核转位介导的线粒体凋亡通路诱导细胞凋亡。2.姜黄素能够抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路,发挥诱导凋亡作用。3.姜黄素通路作用的靶点可能是Akt,通过抑制Akt磷酸化而抑制肿瘤增殖,诱导凋亡。