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定殖是根围促生细菌（Plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR）发挥促生和生防作用的重要前提条件之一。至今人们对PGPR在作物上定殖的了解多局限于定殖形态位置和定殖水平高低，对涉及的基因和分子机制知之甚少，在芽孢杆菌领域尤为如此。本研究从以下4个方面对芽孢杆菌在番茄根表定殖的机制进行探讨。1）枯草芽孢杆菌OKB105在番茄根表定殖突变体筛选和定殖相关基因鉴定;2）Swarming是影响枯草芽孢杆菌OKB105在番茄根表定殖的重要因素;3）yczE基因有助于芽孢杆菌营养细胞忍耐致死高温和解淀粉芽孢杆菌FZB42 swarming运动;4）3株枯草芽孢杆菌在番茄根表的定殖动态以及对促生和生防效果的影响。主要研究结果如下:
1)在进行定殖筛选之前，先对OKB105菌株突变体文库中的600个突变体进行营养缺陷型筛选，从中剔除了11个营养缺陷型突变体。将剩余的589个突变体采用MS琼脂无菌系统和石英砂无菌系统进行定殖突变体的筛选，获得了9株在番茄根尖表现出定殖能力缺陷的突变体，并且这9个突变体在温室盆栽定殖试验中同样定殖缺陷。Southern杂交检测发现9个突变体中有6个是单基因位点突变，其中有3个突变体的转座插入位点相同。通过反向PCR等方法从9个突变体中获得7个插入位点侧翼序列，对侧翼序所在基因进行PCR验证，结果表明其中4个基因的片段长度增加了与转座元件片段长度相同的1500bp，测序和序列比对后在基因的内部找到了转座元件插入的位置。此外，采用同源重组双交换方法将这4个基因分别定点突变后，突变体的定殖水平同样表现出定殖能力缺陷，再次证实了这4个基因参与了枯草芽孢杆菌OKB105在番茄根表的定殖过程。这4个基因分别为:lysC基因，参与半胱氨酸和甲硫氨酸的代谢，能够感应赖氨酸水平，受饥饿响应系统调控;bltR基因，转录因子，调控一个广义的外排转运系统;yjbQ基因，编码细胞膜上的N/H+反向转运系统，维持细胞内的pH和钠离子的平衡;minJ基因，二分裂拓扑学因子，破坏后形成丝线状的多核细胞并失去群集运动(Swarming)能力。它们影响定殖的机制有待于进一步研究。
2)本部分研究枯草芽孢杆菌OKB105的swarming对定殖的影响。鉴于OKB105的swarming调控基因swrA基因退化成了2个swrAA残基，延迟了swarming的启动。首先将解淀粉芽孢杆菌FZB42的swrA基因整合到了OKB105菌株的amyE基因中获得了swarming能力正常的衍生菌株SWR01。以SWR01菌株为对象研究swarming以及其它二个曾被报道影响定殖的因素鞭毛和surfactin，三者对定殖的影响。研究发现，swrA、表面活性素编码基因srfAC和鞭毛编码基因hag被突变后均能影响该菌株在半固体平板上的swarming能力，同时显著地降低菌株在番茄根表的定殖水平，并且swarming能力与在根表的迁移能力成正相关关系。经分析表明，鞭毛、swarming和surfactin都对定殖水平产生重要影响，但是究其原因，鞭毛和surfactin均是通过影响swarming间接地影响定殖的，swarming是重要的影响定殖的直接因素。
3)本部分研究一个被推测可能与定殖相关的yczE基因的功能。该基因的功能未知，编码一个假定的跨膜蛋白。构建了解淀粉芽孢杆菌FZB42、CO6和枯草芽孢杆菌OKB105等3个菌株的yczE基因突变体，并检测了yczE基因对芽孢杆菌一些性状的影响。发现了2个受yczE基因影响的性状:(1)yczE基因有助于芽孢杆菌营养细胞忍耐致死高温。在SSM产孢培养基中培养6～8 h（吸光度OD600=1.4～1.9）阶段，突变体在高温处理后(80℃，20 min)活细胞数量只有野生型的5％～10％。一般认为，芽孢杆菌耐受高温是因为产生芽孢，但是芽孢染色没有检测到成熟的芽孢，表明该时期可能是产孢前期或者更早。通过qRT-PCR检测产孢前期以及一些其他细胞分化途径的相关基因，发现突变体的基因表达水平相当于亲本菌株的0.44～2.31倍，表明yczE基因几乎不影响产孢等细胞分化途径，其作用机理还有待于进一步研究。(2) FZB42菌株的yczE突变体swarming速度减慢，但OKB105和CO6并没有受到影响。据报道影响swarming速度的主要因素是鞭毛数量和表面活性物质的含量。鞭毛染色试验没有检测到yczE突变体的鞭毛数目变化;溶血试验和质谱分析结果显示，突变体的表面活性物质的产量下降但是主要的表面活性物质的种类并没减少。所以，我们认为表面活性物质产量降低是突变体swarming速度下降的直接因素。另外，本研究还检测了yczE基因对抑菌物质的影响。平板抑菌试验结果表明，3个菌株的yczE突变体对于水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.Oryzae)和油菜菌核病菌(Sclerotiniasclerotiorum(Lib.) de Bary)的抑制能力均没有明显改变，同时质谱检测结果表明突变体产生的脂肽类化抗生素的种类也没有减少，说明绝大部分抑菌物质的合成均几乎不受yczE基因的影响。
4)本论文还对3株枯草芽孢杆菌168、OKB105和OKB105Harpin在番茄上定殖动态以及对促生作用和生防效果的影响进行了研究。168是枯草芽孢杆菌模式菌株，OKB105是168衍生菌株能够产生大量的脂肽类抗生素surfactin，OKB105Harpin是本实验室在OKB105的基础上构建的工程菌能够表达植物生防因子Harpin。为了便于检测这3个菌株在番茄根部的定殖情况，用携带绿色荧光蛋白(Green FluorescentProtein，GFP)的穿梭载体pAD43-25对这3株菌株进行标记。经检测，该标记载体在宿主菌中能稳定遗传，并且对宿主菌的生长发育没有明显的影响。在番茄根表的定殖结果表明，在灌根处理后的35天中，3个菌株在番茄根部定殖数量波动一致，均是先呈抛物线趋势然后维持在一个平稳的水平，它们的定殖密度均在同一数量级(104～105CFU/cm)但也存在差异，OKB105定殖密度最高，OKB105Harpin次之，168最低;3个菌株在番茄根表定殖的位置和形态完全一致，在根冠及附近没有检测到细菌定殖，在根毛区及其附近聚集大量的菌体，在根表的其他部位均能检测到散乱分布的菌体，而且它们常常在细胞间隙、伤口、根毛等部位定殖。促生和生防试验结果表明，3个菌株对番茄均有促生效果，其中OKB105最好，促生能力显著;3个菌株均对番茄青枯病有一定的防治效果，OKB105Harpin效果最佳，可达72％。表明足量的定殖有助于促生作用的发挥，生防因子Harpin有助于生防作用的发挥。