论文部分内容阅读
[目的]原发性胆汁性胆管炎(primary biliary cholangitis,PBC)是一种发病机制尚不明确的自身免疫介导的慢性炎症性、胆汁淤积性肝脏疾病。NF-κB-ERK信号通路与组织的炎症反应密切相关,在免疫调节、细胞增殖与分化肿瘤发生等多种生物进程中也起着关键作用。为此,我们选用C57BL/6雌性小鼠诱导建立PBC动物模型,在动物水平的基础上,研究PBC模型小鼠肝脏组织中p65、p50及p-ERK因子的表达,并在此基础上分别使用NF-κB和ERK的特异性抑制剂PDTC和PD98059进行干预,探讨NF-κB-ERK信号通路在PBC小鼠肝组织中的所起作用及意义,为阐明PBC发病机制提供实验基础与理论依据。[方法]本课题通过采用2-辛炔酸-牛血清白蛋白联合聚肌胞甘酸,腹腔注射C57BL/6雌性小鼠,建立PBC小鼠模型,对照组小鼠则不作任何处理。分别取模型组和对照组小鼠的血清和肝脏组织作肝生化检测和病理学检测。采用免疫组织化学法和蛋白免疫印迹法检测小鼠肝脏组织中p65、p50及p-ERK的表达。采用SPSS20.0统计软件进行数据的统计处理,数据分析采用完全随机设计t检验及线性相关分析,数值以均数±标准差(x±s)表示,以P<0.05为差异有统计学意义。在此基础上,分别采用腹腔注射NF-κB和ERK的特异性抑制剂PDTC(100mg/kg)和PD98059(10mg/kg)对PBC小鼠进行干预,选择腹腔注射抑制剂后的12h和24h为时间点,对照组小鼠均在相同时间点腹腔注射相同剂量的生理盐水;采用免疫组织化学法和蛋白免疫印迹法检测PDTC干预组小鼠肝脏组织中p65、p50蛋白表达及PD98059干预组小鼠肝脏组织中p-ERK的表达的变化,对照组检测p65、p50及p-ERK三个因子的表达。采用SPSS20.0统计软件进行统计处理和分析,数据分析采用完全随机设计方差分析及线性相关分析,数值以均数±标准差(x±s)表示,以P<0.05为差异有统计学意义。[结果]1.PBC动物模型建立:(1)小鼠肝生化检测:与对照组相比,模型组小鼠ALP异常升高,ALT和AST水平变化不大。(2)小鼠肝脏HE染色结果:模型组小鼠肝组织汇管区和小胆管周围可见大量炎性细胞浸润和聚集;对照组汇管区及胆管周围未见明显的炎性细胞浸润现象。2.NF-κB-ERK通路在PBC小鼠肝脏中的表达研究:(1)PBC小鼠肝脏p65、p50、p-ERK免疫组化染色结果:PBC组p65、p50及p-ERK高表达,对照组p65、p50及p-ERK低表达或阴性表达。PBC组p65和p50主要表达于Kupffer细胞表面,阳性表达主要位于汇管区及胆管周围;PBC组p-ERK主要表达在Kupffer细胞表面,肝细胞表面也有部分表达。对照组三个因子表达均不明显。PBC组p65、p50及p-ERK评分均显著高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);p-ERK与p65表达水平呈正相关(r=0.942,P=0.000),p-ERK与p50表达水平呈正相关(r=0.906,P=0.002)。(2)PBC小鼠肝脏p65、p50、p-ERK western blotting检测结果:与对照组相比,模型组小鼠肝脏组织中p65、p50、p-ERK相对表达量均显著增高,差异有统计学意义(p65:t=-2.616,P=0.026;p50:t=-4.860,P=0.001;p-ERK:t=-4.813,P=0.001)。p-ERK 与 p65、p50 的表达均呈正相关(r=0.929,P=0.000;r=0.677,P=0.016)。3.阻断NF-κB-ERK通路后PBC小鼠肝脏的表达变化研究:(1)干预后PBC小鼠肝脏p65、p50及p-ERK免疫组化染色结果:与PBC组相比,PBC+PDTC12h组和PBC+PDTC24h组p65、p50表达量均有下降,胞质内仍有部分表达,差异有统计学意义(p65:F=37.243,P=0.000;p50:F=64.119,P=0.000);PBC+PD98059 12h 组和 PBC+PD98059 24h 组p-ERK表达量均有下降,胞质内仍有部分表达,差异有统计学意义(F=26.457,P=0.000)。NS对照组无明显变化。(2)干预后PBC小鼠肝脏p65、p50及p-ERKwestern blotting结果:与PBC组相比,PBC+PDTC12h处理组和PBC+PDTC24h处理组p65、p50表达量均明显下降,差异有统计学意义(p65:F=11.01,P=0.021;p50:F=13.76,P=0.000);PBC+PD9805912h组和PBC+PD98059 24h组p-ERK表达量明显下降,差异有统计学意义(F=14.51,P=0.000)。NS对照组无明显变化。[结论]1.20A-BSA联合PolyI:C免疫能够成功诱导建立原发性胆汁性胆管炎小鼠模型;2.PBC小鼠肝脏内p65、p50、p-ERK表达量增加,p-ERK与p65和p50的表达均呈正相关,提示PBC时NF-κB-ERK信号通路处于激活状态;3.经PDTC处理后小鼠肝脏内p65、p50表达降低,经PD98059处理后小鼠肝脏内p-ERK表达降低,提示PDTC和PD98059分别能够特异性抑制NF-κB-ERK信号通路的表达。