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[目的]建立一种快速、准确和标准化的广地龙DNA条形码鉴别方法,采用国际通用动物的DNA条形码COI基因序列及16SrRNA基因对广地龙及其它地龙原动物共3个科5个属9个物种的序列进行比较研究,同时,探讨了12SrRNA基因和Cyt b基因对广地龙原动物分子鉴定的可行性,从线粒体COI、16SrRNA、12SrRNA和Cyt b4个基因片段中筛选出适用于地龙物种鉴定的DNA条形码,将DNA条形码技术应用于市售的地龙药材及未知蚯蚓物种的鉴别。[方法]1.测定5条不同居群广地龙的COI和16SrRNA基因序列及2条不同居群广地龙的12SrRNA和Cyt b基因序列,采用CodonCode Aligner进行序列拼接,结合GenBank数据库中相关蚯蚓的COI、16SrRNA、12SrRNA和Cyt b序列,采用MEGA4.1软件计算广地龙的种内及地龙物种种间的K2P距离,并基于K2P模型构建NJ树和MP树。2.利用TAXON DNA软件对GenBank数据库中所有地龙原动物的COI及16SrDNA序列进行barcoding gap检验,确定适合地龙物种的DNA条形码。3.通过提取待鉴定地龙药材和新鲜蚯蚓的基因组DNA,采用PCR技术和DNA测序技术获得线粒体COI基因序列,与已获得的广地龙的COI标准基因序列比较分析,确定待鉴定样品是否为广地龙。[结果]1.本研究获得地龙药材最佳DNA提取方案为：前处理阶段,采用含高浓度EDTA(0.1M)的浸泡液,地龙药材在浸泡液中浸泡时间为24h；提取阶段,将把蛋白酶K(20mg/mL)的量增加到50μ L,加入抗氧化剂二硫苏糖醇(DTT)以及螯合树脂Chelex,水浴时间为4h能取得较好质量的DNA；提取后阶段,将DNA于-20℃中沉淀12h能取得最佳效果；PCR扩增前阶段,应用DNA纯化试剂盒纯化后再进行PCR扩增,能减少PCR反应条件摸索的时间和精力。2.广地龙C0I、16SrRNA、12SrRNA和Cyt b基因片段除去引物获得片段长度分别为638bp、450bp.370bp和307bp,COI变异位点、信息位点均高于16SrRNA和12SrRNA,COI基因无插入和缺失,16SrRNA存在4个插入和缺失,12SrRNA存在20个插入和缺失,碱基使用频率均有明显的A、T偏向性。3.采用MEGA4.1软件计算地龙物种的K2P距离,基于COI基因广地龙种内的遗传距离介于0.000-0.029之间,种间的遗传距离介于0.167-0.316之间,平均遗传距离0.195平均转换颠换比R为1.31,基于16SrDNA基因广地龙种内的遗传距离介于0.000-0.009之间,种间的遗传距离介于0.063-0.238之间,平均遗传距离0.149,平均转换颠换比R为2.158。基于COI基因构建MP树,一致性指数(CI)=0.962,保持性指数(RI)=0.786,基于16SrRNA基因构建的MP树,一致性指数(CI)=0.839,保持性指数(RI)=0.588。基于12SrRNA基因构建的MP树获得的一致性指数(CI)=0.718及保留指数(RI)=0.727,基于邻接法(Neighbor-Joining, NJ)和最大简约法(Maximum-Parsimony, MP)构建的COI、16SrRNA和12SrRNA基因分子系统树显示各分支均有较高的支持率和稳定的拓扑结构,同一物种的不同个体聚为一支,不同物种能明显区分开来,聚类结果支持传统分类结果。4.对GenBank数据库中所有地龙的COI及16SrDNA序列进行barcoding gap检验,COI序列有明显的bar cod ing gap,种间与种内正态分布图呈两边分开,COI基因种内的遗传距离集中在1.5%之内,种间的遗传距离集中在14%之后,而16SrDNA基因片段的barcoding gap不明显。[结论]1.针对药材干品基因组DNA提取的难点,本研究应用改进了的从陈皮旧张提取DNA方法,能成功地从地龙药材中提取到基因组DNA,所得DNA浓度高,可以满足下游PCR实验的要求。2.应用COI、16SrRNA和12SrRNA基因序列对蚯蚓的分类做了初步探讨,分类结果与传统分类相一致,结果表明线粒体C0I、16SrRNA和12SrRNA基因均能够将广地龙与其他蚯蚓物种鉴别开来,可作为广地龙种类鉴定的良好分子标记。3.对COI及16SrDNA基因序列进行barcoding gap检验,及综合考虑基因变异位点、信息位点及有无插入或缺失位点等因素,表明COI基因比16SrDNA基因更适合作为地龙物种的DNA条形码。4.本研究所得结果验证了参环毛蚓Pheretima aspergillum与参状远盲蚓Amynthas aspergillus是不同分类方法的同一物种,此外,从进化角度看,钜蚓科中的远盲蚓属Amynthas和腔蚓属Metaphire有着较近的进化关系,可能是协同进化关系。