论文部分内容阅读
从中药中筛选抗肿瘤活性成分以及抗肿瘤先导化合物是抗肿瘤药物研究领域的一大热点,如紫杉醇、喜树碱、长春新碱等天然成分己作为许多肿瘤治疗的首选药物。我国的药用植物自然资源丰富,如果能将中药抗肿瘤有效成分分离出来,明确其抗肿瘤作用及机理,对于抗肿瘤药物的研制开发具有非常重要的意义。鞘蕊苏为民间中药,具有清热利湿、散寒解表、祛痰止咳之功效,民间将其用于治疗哮喘、肿瘤等疾患,疗效显著,具有广泛的生理活性。其植物名为毛喉鞘蕊花Coleus forskohlii Briq.,系唇形科（Labiatae）鞘蕊花属（Coleus lour.）植物,印度民间称其为“神药”,我国民间则称之为“灵药草”。现代药理研究表明,鞘蕊苏提取物对支气管哮喘、充血性心力衰竭、抑制肿瘤细胞增殖等具有明显药效。为了阐明鞘蕊苏的抗肿瘤药效物质基础及作用机制,寻找抗肿瘤活性先导化合物,本论文结合实验室前期研究基础,主要从以下四个方面进行研究:1.运用中药化学、药理学和分子生物学的学科交叉研究方法,采用系统溶剂方法将鞘蕊苏提取分离为不同物质部位,通过生物活性跟踪分离,从中筛选抗肿瘤有效物质部位Q3,采用色谱方法将活性部位进一步分离纯化,用MTT法从鞘蕊苏药材中筛选出系列抗肿瘤有效成分,其中14-去氧鞘蕊酮U（14-Deoxycoleon U）表现出良好的抗肿瘤活性。2.通过体内和体外实验检测14-去氧鞘蕊酮U的抗肿瘤药效。通过对四种肿瘤细胞株的生物活性筛选,MTT实验结果表明14-去氧鞘蕊酮U对不同肿瘤细胞增殖均有较显著的抑制作用,抗癌谱较广;且有一定的选择性,结果表明14-去氧鞘蕊酮U的敏感瘤株为A549和LLC细胞,对人肺腺癌细胞株A549(IC50=18.99μg/mL)和小鼠肺癌细胞LLC(IC50=10.04μg/mL)抑制增殖作用显著;体内实验利用C57BL/6小鼠的Lewis肺癌模型研究14-去氧鞘蕊酮U的体内抗肿瘤活性,结果显示,与空白对照组相比,14-去氧鞘蕊酮U对肿瘤的生长具有明显的抑制作用,抑瘤率达到40.38%;与空白对照组相比,小鼠体重平稳,肝、肾、脾、肺各脏器系数与无明显影响,表明14-去氧鞘蕊酮U是一种天然的安全性较高的活性成分。3.运用体外实验进一步探讨14-去氧鞘蕊酮U诱导肿瘤细胞凋亡、自噬和周期阻滞的分子机制,探讨其抗肿瘤作用机制,为14-去氧鞘蕊酮U抗肿瘤药物研发和临床应用提供重要的理论指导和实验依据。通过Hoechst 33258染色观察不同浓度14-去氧鞘蕊酮U对A549细胞凋亡形态学变化,实验结果显示随着14-去氧鞘蕊酮U浓度的增加发现细胞核或细胞质内可见浓染致密的颗粒状荧光,细胞的凋亡小体逐渐增多,表明14-去氧鞘蕊酮U能够诱导肿瘤细胞凋亡发生。通过蛋白免疫印迹法（Western Blot,WB）检测A549和LLC细胞中凋亡相关蛋白的表达,实验结果表明,14-去氧鞘蕊酮U通过诱导半胱氨酸蛋白酶Caspase3和PARP表达增加来诱导细胞凋亡,且成剂量依赖性关系;但对促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2没有显著影响,结果表明14-去氧鞘蕊酮U不能通过下调Bcl-2蛋白表达,上调Bax蛋白表达这条线粒体途径来诱导A549和LLC细胞凋亡。通过WB检测A549和LLC细胞中内质网应激（ER stress）介导的相关蛋白的表达,实验结果表明,14-去氧鞘蕊酮U上调了IRE1-α,XBP1s和CHOP的表达,提示ER应激被激活,ER stress发生caspase-12或caspase-4被激活,14-去氧鞘蕊酮U诱导细胞发生了内质网和线粒体联合应激,并最终导致细胞凋亡发生。运用Alexa Fluor?488 Conjugated LC3Ⅰ/Ⅱ染色荧光分析实验,通过激光共聚焦扫描显微镜观察14-去氧鞘蕊酮U对A549细胞自噬相关蛋白和自噬体的影响,实验结果证实14-去氧鞘蕊酮U能够促进细胞自噬体的形成,诱导A549和LLC的细胞自噬发生。进一步通过WB检测A549和LLC细胞中自噬相关蛋白的表达,结果显示14-去氧鞘蕊酮U可上调LC3II/I蛋白的比例和Atg5的表达,对Beclin-1蛋白表达无明显影响,表明14-deoxycoleon U通过上调LC3II/I和Atg5促进细胞自噬体的形成和诱导细胞凋亡。通过WB检测A549和LLC细胞中周期阻滞相关蛋白的表达,实验结果显示14-去氧鞘蕊酮U下调细胞周期蛋白D3（CyclinD3）、细胞周期蛋白依赖性激酶6（CDK6）,细胞分裂周期蛋白2（CDC2）和上调p21,表明14-去氧鞘蕊酮U可以通过影响CyclinD3、CDK6、CDC2和p21蛋白表达从而抑制细胞从G2进入M期,引起肿瘤细胞周期阻滞。但是,由周期蛋白E激活并导致G1/S过渡的CDK2不受14-去氧鞘蕊酮U的影响。4.根据鞘蕊苏抗肿瘤活性成分的结构特点和化学合成可行性,为增强抗肿瘤活性,选取鞘蕊苏抗肿瘤活性成分二萜类化合物Coleolic acid为先导化合物,在分子中引入小分子抗肿瘤药物中常见的苯环、杂环等基团,在Coleolic acid的11位碳上设计并合成了18个新型的Coleolic acid衍生物,所有终产物经1H NMR、13C NMR结构确证。实验结果证明所采用的合成路线经济、操作简便和收率较高,通过MTT检测了它们的体外抗肿瘤活性,筛选出抑制肿瘤细胞增殖活性最优化合物PX15,其IC50值为1.84μg/mL,与先导化合物Coleolic acid(IC50=40.47μg/mL)相比,有了很大的提高。综上所述,本研究结合生物活性跟踪分离,从鞘蕊苏中筛选出单体活性成分14-去氧鞘蕊酮U,并在细胞水平、整体动物水平、和分子水平三方面探讨其抑制肿瘤细胞增殖的作用和机制,并以抗肿瘤有效成分Coleolic acid为先导化合物,通过结构改造,合成系列衍生物,发现有研究前景的抗肿瘤活性化合物,为鞘蕊苏抗肿瘤研究提供物质基础,为研制抗肿瘤化学药物提供可供进一步优化的先导化合物。