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研究背景:糖尿病的患病率逐年上升,目前已成为严重威胁人类健康的疾病之一,胰岛β细胞凋亡增加是糖尿病发生、发展的关键因素[1]。近年来有研究表明,2型糖尿病患者体内长期高水平的游离脂肪酸(free fatty acids,FFAs),特别是饱和脂肪酸可以引起胰岛素抵抗、胰岛β细胞功能紊乱,以及β细胞凋亡的增加,进而加重糖尿病[2-4]。硫氧还蛋白相互作用蛋白(Thioredoxin interacting protein,TXNIP)又名VDUP1(Vitamin D(3)up-regulated protein 1)和TBP2(Thioredoxin-binding protein-2),属于α抑制蛋白家族,是目前发现的唯一内源性的硫氧还蛋白(Thioredoxin,Trx)结合抑制蛋白,在糖尿病各组织中其表达均显著升高,已有大量研究证明高糖可引起TXNIP表达明显升高,并介导β细胞功能损伤和凋亡[5-7]。但是,作为糖尿病主要损伤因素之一的游离脂肪酸,其对TXNIP表达的影响,以及不同饱和程度的游离脂肪酸对TXNIP表达的可能差别目前尚不清楚。因此本课题旨在研究不同饱和程度的脂肪酸对INS-1胰岛细胞TXNIP表达的影响,并分析其可能机制。目的:1.使用不同饱和程度的游离脂肪酸孵育INS-1细胞,观察不同类型脂肪酸对INS-1胰岛细胞凋亡及TXNIP表达的影响。2.分析脂肪酸调节TXNIP表达的可能机制。方法:1.实验分组:将正常培养的INS-1细胞分为四组:分别是正常对照组(含0.55%fatty acid free-BSA的RPMI1640培养基)、饱和脂肪酸-软脂酸组(0.5 mmol/L软脂酸+0.55%fatty acid free-BSA)、单不饱和脂肪酸-棕榈油酸组(0.5 mmol/L棕榈油酸+0.55%fatty acid free-BSA)、多不饱和脂肪酸-DHA 组(0.5 mmol/L DHA+0.55%fatty acid free-BSA),均于培养24 h后收集细胞进行指标测定。2.采用Real-time PCR方法测定FFAs处理后INS-1细胞TXNIP mRNA表达量。3.采用 Western blot方法检测FFAs处理后 INS-1 细胞 TXNIP、Cleaved caspase-3、Caspase-3、ChREBP、FOXO1、p-NF-KB 蛋白表达。4.采用免疫荧光技术检测FFAs处理后INS-1细胞中ChREBP蛋白表达。5.使用Annexin V-FITC/PI染色流式细胞术检测INS-1细胞凋亡情况。结果:1.不同饱和程度的FFAs对INS-1细胞TXNIP表达的影响不同。与对照组相比,饱和脂肪酸软脂酸组TXNIP mRNA和蛋白表达均显著上调,而不饱和脂肪酸棕榈油酸组和DHA组INS-1细胞TXNIP表达均没有明显的改变(见图1)。如图2所示,软脂酸引起的TXNIP的蛋白表达从18 h开始增加,并于24 h达到最高。36 h时,软脂酸诱导的TXNIP表达降低到原蛋白水平。而棕榈油酸和DHA在12 h、18 h、24 h、36 h不同的时间点对TXNIP表达与对照组相比均无统计学差异。2.FFAs由于其饱和程度的不同对INS-1细胞凋亡也具有不同的影响。如图3所示,软脂酸组Cleaved caspase-3/caspase-3的比值与对照组相比明显增加。棕榈油酸组和DHA组Cleaved caspase-3/caspase-3比值与对照组相比无显著性差异。流式细胞术结果显示,软脂酸组INS-1细胞的凋亡指数明显增加,而棕榈油酸组和DHA组对INS-1细胞凋亡的影响与对照组相比无统计学差异(见图4)。3.软脂酸对转录因子ChREBP和FOXO1蛋白表达的影响。使用Western blot和免疫荧光方法研究发现,与对照组相比软脂酸组ChREBP蛋白表达显著上调,转录因子FOXO1蛋白表达降低。(见图5-6)4.软脂酸调节INS-1细胞TXNIP蛋白表达与NF-κB磷酸化相关。与对照组相比,软脂酸组p-NF-κB p65蛋白表达量明显增加(见图7)。加入NF-κB抑制剂PDTC后,与不加抑制剂组相比,软脂酸孵育后引起的TXNIP mRNA和蛋白水平的上调受到明显的抑制(见图8)。同样,使用一种多肽类的NF-κB抑制剂SN50也可降低软脂酸诱导的TXNIP表达上调(见图9)。同时发现,PDTC能够显著降低软脂酸诱导的ChREBP表达上调(见图10),而对软脂酸下调FOXO1的表达没有影响(见图11)。5.p38 MAPK参与软脂酸诱导的TXNIP表达上调。与不加抑制剂组相比,使用p38 MAPK抑制剂SB203580可显著抑制软脂酸处理后引起的INS-1细胞TXNIP mRNA和蛋白水平的增加(见图12)。同时,SB203580也可阻断了软脂酸诱导的p-NF-κB p65蛋白表达上调(见图13),以及软脂酸对转录因子ChREBP和FOXO1蛋白表达的调节作用(见图14,15)。结论:1.饱和脂肪酸软脂酸可能通过诱导TXNIP表达上调,进而促进了 INS-1胰岛细胞凋亡。而不饱和脂肪酸棕榈油酸和DHA对TXNIP表达以及INS-1细胞凋亡均无显著作用。2.软脂酸上调TXNIP表达的机制与p38 MAPK/NF-κB/ChREBP信号通路有关,FOXO1可能也参与了 TXNIP的调节。