猪支原体肺炎(Mycoplasmal pneumonia of swine,MPS)又称为猪气喘病,广泛流行于世界各国的养猪场,对养猪业造成极为严重的经济损失。猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)是引起该病的主要病原菌。现有研究发现,不同猪种对Mhp感染表现出较大差异的易感性,中国地方猪种对Mhp的易感性高于引入猪种,如高繁殖力的姜曲海猪、二花脸猪、梅山猪等地方猪种相对于杜洛克猪、长白猪等引入猪种表现出严重的气喘病。但是,不同品种对Mhp易感性的分子遗传机制尚不清楚。因此,本研究以地方猪种(姜曲海猪)、培育猪种(苏姜猪)和引入猪种(长白猪和杜洛克猪)为研究对象,通过流行病学调查和人工感染试验,从临床症状、病理特征、体液免疫、基因表达等方面系统分析并验证中外猪种Mhp易感性的差异。此外,以姜曲海猪和杜洛克猪为素材,利用高通量测序技术测定并比较分析两个品种感染Mhp后肺组织中mRNA、lncRNA和miRNA表达模式的相同点和异同点,分析差异表达mRNA、lncRNA和miRNA在机体抵抗Mhp感染过程中的免疫调控作用,以进一步揭示中外猪种Mhp易感性差异的分子遗传机制。主要试验结果如下:1.江苏苏中地区猪支原体肺炎流行病学调查及分析为揭示不同猪种Mhp易感性的差异,对苏中地区3个不同品种猪群(姜曲海猪、苏姜猪、长白猪)进行流行病学调查,采集生产猪群中的471份血清样本和屠宰场469份肺脏样本,比较了 3个品种的Mhp抗体阳性率、抗原阳性率及肺组织病变等指标。结果显示,姜曲海猪群血清抗体阳性率、肺组织抗原阳性率及平均肺组织病变指数分别为48.51%、54.08%和2.20,各指标均高于苏姜猪和长白猪。结果说明,不同猪种的Mhp易感性存在差异,地方猪种姜曲海猪的Mhp易感性高于培育猪种和引入猪种。2.姜曲海猪和杜洛克猪Mhp易感性差异的免疫基础研究为探明不同猪种Mhp易感性差异的免疫基础,构建Mhp人工感染试验,对姜曲海猪和杜洛克猪两个品种感染Mhp后的临床症状、病理特征、体液免疫、基因表达等方面进行系统的研究。结果发现,两个品种感染相同剂量Mhp后,姜曲海猪比杜洛克猪较早出现支原体肺炎临床症状,姜曲海猪的生长速度受到显著影响,表现出严重的肺组织病变,产生更高浓度的Mhp抗体、IgG和IgM。在两个品种的肺和脾组织中对先天性免疫受体(TLR4)和炎性因子(IL-1β、IL-6、IL-4)的表达量进行检测,4个基因在杜洛克猪感染组中的表达水平极显著高于杜洛克猪对照组(P<0.01),而在姜曲海猪感染组中,仅检测到IL-1β基因在脾组织中的表达水平极显著高于姜曲海猪对照组(P<0.01)。结果说明,两个品种存在抵抗Mhp感染差异的免疫基础,这为下一步研究不同猪种Mhp易感性差异的分子遗传机制提供了素材。3.姜曲海猪和杜洛克猪Mhp易感性差异的分子遗传机制研究(1)为进一步阐明不同猪种Mhp易感性差异的分子遗传机制,对姜曲海猪和杜洛克猪两个品种感染Mhp 28 d的肺组织进行高通量测序表达谱分析,采用品种内比对(感染组vs对照组)来筛选差异表达转录本,结果在两个品种肺组织中分别获得2250个和3526个差异表达mRNAs,384个和499个差异表达lncRNAs,55个和87个差异表达miRNAs。随机选择13个差异表达转录本(6个mRNAs、2个lncRNAs和5个miRNAs)进行定量PCR验证,结果与高通量测序的结果基本一致。(2)通过测序数据分析,在两个品种中筛选到1669个共享差异表达mRNAs,涉及到TLR2、TLR4、TLR6、PIK3R5、CXCL8、CXCL13、IL-1β、IL-4、ITGA1、ITGB7 等免疫应答基因,富集到细胞因子间受体相互作用、趋化因子信号通路、PI3K-Akt信号通路、cGMP-PKG信号通路、ECM受体相互作用等免疫应答信号通路。这些基因表达及信号通路被激活,体现了两个品种感染Mhp后可能具有相同的免疫应答进程,包括激活了抗原识别、信号传导、炎症反应等免疫应答进程。(3)姜曲海猪拥有563个特异性差异表达mRNAs,涉及到99个免疫应答基因,其中粘附分子(PECAM1、CD34、CD7、CDH4)、WNT分子(WNT11、WNT16)等免疫应答基因呈现表达下调。这些基因表达受到抑制,可能干扰姜曲海猪建立有效的免疫应答机制来抵抗Mhp的感染。杜洛克猪拥有1857个特异性差异表达mRNAs,涉及到253个免疫应答基因,其中较多免疫应答基因呈现表达上调,包括趋化因子(CCL4、CCL5、CCR1、CCR5、CXCL2、CXCL10、CXCL12、CXCR6)、干扰素因子(IFNAR2、IFNG)、白细胞介素(IL-6、IL-10、IL-15RA、IL-2RA、IL-18RAP、IL-2RB、IL-2RG、IL-27RA、IL-7R)等。这些基因表达的激活,可能有利于机体的免疫应答进程。另外,杜洛克猪特异性差异表达mRNA还富集到抗原加工与呈递、Toll样受体信号通路、趋化因子信号通路、细胞凋亡等免疫应答信号通路。结果说明,两个品种还存在差异的分子免疫调控机制,杜洛克猪在抵抗Mhp感染的过程中,差异表达mRNA在调控抗原识别、信号传导、炎症反应、细胞凋亡等免疫应答的能力优于姜曲海猪。(4)对两个品种筛选得到的差异表达lncRNA和miRNA靶基因进行功能富集分析,结果与差异表达mRNA富集的信号通路及功能基本相似。杜洛克猪差异表达lncRNA、miRNA特异性参与调控趋化因子信号通路、Toll样受体信号通路、细胞凋亡等免疫应答信号通路,调控抵抗Mhp感染的免疫应答能力也同样优于姜曲海猪。(5)在杜洛克猪中筛选到678个mRNAs、47个miRNAs、80个lncRNAs存在ceRNA关联。综合分析测序结果,鉴定出10个可能影响机体免疫应答的关键基因(CXCL10、CXCL12、MAP3K8、CALR、MAP2K6、MAPK10、PTK2B、AKT3、IL18RAP、C7)。选择其中4个基因(CXCL10、CXCL12、MAP3K8、IL18RAP)在免疫器官(肺部淋巴结和脾组织)中检测表达水平,4个基因在杜洛克猪感染组中的表达水平均显著高于姜曲海猪感染组(P<0.05或P<0.01),结果进一步说明在抵抗Mhp感染过程中两个品种之间存在差异的分子免疫应答机制。综上所述,姜曲海猪和杜洛克猪两个品种之间存在明显的Mhp易感性差异,两个品种抵抗Mhp感染的分子免疫应答机制存在差异,杜洛克猪差异表达mRNA、miRNA、和lncRNA在调控抵抗Mhp感染的免疫应答能力优于姜曲海猪。此项研究揭示中外猪种Mhp易感性差异的分子遗传机制,为进一步研究Mhp致病机制和筛选抗性分子标记奠定了基础。