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研究背景与研究目的:肝脏是人体内脏里最大最重要的器官,以代谢功能为主。在人体内不仅能去氧化、储存肝糖原、合成分泌型蛋白质,在药物和毒素的代谢、解毒等方面也起着关键作用。急性肝衰竭（Acute liver failure,ALF）是一种以肝功能突然下降继发的黄疸、凝血障碍、肝性脑病等为特征的临床综合征,影响多脏器功能,死亡率高达90%。原位肝移植是治疗ALF的有效方法之一,但由于肝脏供体有限、移植费用高昂,严重制约了ALF患者接受肝移植治疗的覆盖率,使其不能成为临床普及的治疗方法。因此,寻找新的治疗ALF的方法势在必行。人脐带间充质干细胞（Human umbilical cord mesenchymal stem cells,h UCMSCs）是一种具有自我更新能力和多向分化的基质细胞。有学者发现间充质干细胞能通过旁分泌的方式产生一些具有修复作用的细胞因子,可作用于肝脏和肾脏,以促进其相应的损伤修复。外泌体属于细胞外囊泡的一种,干细胞来源的外泌体在各类疾病尤其是肝脏疾病治疗方面具有良好的潜能,在再生医学、疾病模型、药物筛选以及精准医疗等领域均具有广阔的应用前景。人脐带间充质干细胞来源的外泌体（Human umbilical cord mesenchymal stem cells exosomes,h UCMSC-Exo）对ALF是否具有治疗作用?h UCMSC-Exo治疗ALF的作用机制和分子机制具体是什么?到目前为止,均鲜有相关报道。本文旨在探讨h UCMSC-Exo对治疗对乙酰氨基酚（Acetaminophen,APAP）诱导的ALF的作用机制及其生物学原理,从而为治疗ALF的新靶点和新方法的探究提供实验依据。实验方法:1.h UCMSCs及h UCMSC-Exo的分离、培养及鉴定:1)采用胶原酶II消化法从脐带上分离、培养h UCMSCs;2)利用流式细胞术检测h UCMSCs表面分子标志;3)成骨成脂分化检测h UCMSCs体外多向分化潜能;4)超速离心法提取h UCMSC-Exo,并利用透射电镜分析h UCMSC-Exo形态及粒径;5)使用Western blot法检测h UCMSC-Exo标志蛋白。2.h UCMSC-Exo抑制APAP诱导的急性肝衰竭小鼠肝细胞的坏死和凋亡的潜能及作用机制研究:1)以380 mg/kg剂量注射APAP后,评估经过尾静脉注射PBS或者h UCMSC-Exo的APAP损伤的小鼠的生存率,再利用尾静脉注射PKH26标记的h UCMSC-Exo经过活体成像确定作用部位;2)利用HE染色及TUNEL凋亡染色检测不同组别小鼠肝脏中肝细胞凋亡;通过肝功能分析检测不同组别小鼠肝功能情况;3)利用免疫荧光和酶标仪等检测测定急性肝衰竭小鼠体内与氧化压力相关的一系列指标,如GSH、SOD、MDA、4-HNE、CYP2E1等;4)利用q RT-PCR检测ALF小鼠体内炎症因子的表达。3.h UCMSC-Exo抑制肝细胞坏死并促进损伤修复的分子机制研究:1)体外利用APAP建立人正常肝细胞系LO2的肝衰竭模型,并利用PKH26标记的h UCMSC-Exo与LO2细胞共培养观察细胞摄取情况;2)检测正常培养组、损伤组、损伤后h UCMSC-Exo共培养组ROS和MDA等氧化指标的变化;3)利用Annexin V/PI流式细胞凋亡实验、CCK8实验、Western blot实验检测正常培养组、损伤组、损伤后h UCMSC-Exo共培养组细胞的凋亡和增殖情况;4)Western blot检测正常培养组、损伤组及h UCMSC-Exo组细胞中IGF-1R-PI3K-AKT及ERK1/2信号通路相关蛋白表达;5)损伤后h UCMSC-Exo共培养组细胞中加入LY294002（AKT抑制剂）及PD98059（ERK1/2抑制剂）,利用Annexin V/PI流式、CCK8及Western blot检测上述信号通路在h UCMSC-Exo抑制肝细胞坏死并促进损伤修复中发挥的作用。实验结果:1.h UCMSCs及h UCMSC-Exo的特性:1)利用胶原酶II消化法可从脐带上分离培养得到具有长梭形形态的h UCMSCs,且h UCMSCs细胞形态有呈漩涡状生长或平行排列的趋势;2)流式细胞技术表明h UCMSCs表达间充质干细胞标志基因CD105、CD73、CD90、CD29,不能表达造血干细胞相关标志基因CD34及CD45;3)h UCMSCs体外在适当条件下可分化为脂肪细胞和骨细胞;4)透射电镜表明h UCMSC-Exo为直径在30-150 nm的囊泡;5)h UCMSC-Exo表达外泌体标志蛋白CD9、CD63、CD81和Rab5。2.h UCMSC-Exo体内移植可通过抑制肝细胞的凋亡、缓解氧化应激压力促进APAP所诱导的急性肝衰竭损伤修复:1)h UCMSC-Exo体内移植能明显改善ALF小鼠的生存率,活体成像显示大部分h UCMSC-Exo在肝脏富集;2)TUNEL凋亡检测表明h UCMSC-Exo可以抑制肝细胞凋亡,HE染色显示h UCMSC-Exo能明显减少APAP所导致的肝小叶中心坏死,肝功能指标检测表明h UCMSC-Exo能明显改善ALF小鼠的肝功能;3)h UCMSC-Exo能显著恢复ALF小鼠体内GSH、SOD活性,抑制MDA含量的升高。免疫荧光染色法显示h UCMSC-Exo能明显逆转ALF小鼠肝组织中4-HNE和CYP2E1的过表达;4)q RT-PCR检测表明h UCMSC-Exo可使APAP损伤的肝组织中促炎细胞因子IL-6、IL-1β和TNF-α显著降低。3.h UCMSC-Exo通过活化IGF-1R/PI3K/AKT和ERK1/2信号通路抑制APAP损伤LO2细胞氧化压力及凋亡:1)h UCMSC-Exo容易被LO2细胞所摄取;2)h UCMSC-Exo能降低APAP损伤的LO2细胞内的ROS和MDA的含量;3)h UCMSC-Exo通过激活IGF-1R/PI3K/AKT和ERK1/2信号通路抑制APAP损伤LO2细胞氧化压力及凋亡。结论:1.h UCMSCs增殖能力强、表达间充质干细胞标志基因、不表达造血干细胞标志基因,具有多向分化潜能,可定向分化为脂肪细胞及骨细胞。其衍生的外泌体粒径大小在在30-150 nm之间,且表达外泌体标志蛋白;2.h UCMSC-Exo体内移植能促进APAP诱导的急性肝衰竭小鼠肝功能的恢复,其机制与h UCMSC-Exo抑制损伤的肝细胞的坏死、凋亡以及减缓氧化应激有关;3.h UCMSC-Exo能够被LO2细胞所摄取,然后通过激活APAP损伤LO2细胞中的IGF-1R/PI3K/AKT和ERK1/2信号通路,进而抑制APAP损伤LO2细胞氧化压力及凋亡。