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研究背景:肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC),以下简称肝癌,是一种高发病率高致死率恶性肿瘤,是肝脏恶性肿瘤最常见的病理类型。肝癌的致病因素主要包括:乙肝病毒感染、丙肝病毒感染、黄曲霉毒素摄入、酗酒、高脂饮食等,我国是乙肝病毒感染高发国家,因此肝癌的防治显得尤为重要。肝癌切除术及肝脏移植是治疗早期肝癌的主要手段,而由于肝癌早期症状不明显,多数病人在就诊时往往处于疾病中晚期且伴有肝硬化。因此,在肝癌确诊时,只有少部分病人适合接受根治性治疗。此外,肝癌术后复发转移是影响病人预后的另一重要因素,因此,寻找高敏感性及特异性诊断标记物以提升肝癌早诊率,使更多肝癌病人适合接受根治性治疗,同时明确与肝癌复发转移相关的分子靶点及信号通路进行早期精准干预,以改善病人术后生存率。研究目的:1.探究并验证新型分子标记物—谷氨酰胺合成酶在肝癌诊断及预后评估中的应用价值;2.初步解析谷氨酰胺合成酶对肝癌细胞增殖及转移的影响,并阐述其潜在调控机制。研究方法:1.本研究基于肝癌病人临床样本,应用蛋白质组学、酶联免疫吸附试验、免疫组化检测等方法寻找、验证并探索肝癌组织特异性高表达分子标记物及其临床应用价值。首先对原发性肝癌(病理诊断证实且根治性肿瘤切除术前未接受过其他抗肿瘤治疗)病人手术切除的肿瘤组织及对应癌旁组织(n=20)进行双向荧光差异凝胶电泳联合质谱分析(蛋白质组学)筛选差异表达蛋白作为候选标记物进行研究。然后,利用酶联免疫吸附法检测新纳入的原发性肝癌病人(n=115)及健康人(n=57)血清中该候选标记物—谷氨酸胺合成酶(glutamine synthetase,GS)及甲胎蛋白(α-fetal protein,AFP)的浓度,比较分析二者对HCC的诊断价值,并重点研究GS对AFP阴性肝癌(n=75)的诊断价值。接下来,应用免疫组织化学染色法检测新纳入的肝癌病人(n=153)肿瘤组织及对应癌旁组织中GS的表达量差异,并结合病人临床病理学特征及预后信息分析GS在不同肝癌病人肿瘤组织中的表达量差异与肝癌恶性程度的相关性并研究其预后评判价值。最后,基于TCGA数据库中的肝癌队列(n=364)分析GS-mRNA表达量对肝癌病人预后的影响。2.基于细胞功能学检测及通路分析、动物肝癌转移模型构建及肝癌病人肿瘤组织中相关蛋白检测,开展GS在肝癌增殖及转移中的作用及潜在机制研究。首先,在细胞实验中,应用GS干扰慢病毒沉默Huh7细胞(野生型Huh7细胞GS高表达)中GS的表达,应用含有GS过表达质粒的慢病毒感染HCCLM3及BEL-7402细胞(野生型HCCLM3及BEL-7402细胞中GS低表达)以增加GS表达量,应用q-PCR及western blot实验验证干扰及过表达效率,构建稳定转染肝癌细胞株。并通过MTT、克隆形成及transwell实验分别检测GS在体外对肝癌细胞增殖、克隆形成及迁移能力的影响;同时应用western blot技术检测GS表达变化对肝癌细胞mTOR/p-S6通路及上皮间质转化相关蛋白的影响。然后,选择GS过表达的高转移潜能肝癌细胞系-HCCLM3构建肝癌细胞裸鼠体内肝肺转移模型对GS异常表达在体内对肝癌细胞侵袭能力的影响进行研究。最后,应用免疫组化技术对肝癌病人肿瘤组织中GS及mTOR通路激活的标记蛋白—p-S6-S235/236和p-S6-S240/244进行染色评分并进行相关性分析,初步探索其影响肝癌恶性进展的机制。研究结果:1.蛋白质组学分析发现,有20种蛋白在肝癌组织中的表达量明显高于对应癌旁组织(差异倍数≥1.5倍),其中GS在肿瘤组织中的表达量是癌旁组织的20.12倍(p=0.028),因此,将其作为本次研究的候选标记物,针对其临床价值及促癌机制进行后续探索。酶联免疫吸附试验发现肝癌病人血清中GS(853.2±785.4ng/ml vs 228.5±113.8ng/ml,p<0.001)及 AFP(235.2±584.4ng/ml vs 18.3±6.6ng/ml,p<0.001)的浓度明显高于健康对照者,其对肝癌具有较高诊断效能(ROC曲线下面积分别为0.848、0.861),并且在AFP阴性的肝癌病人血清中GS的浓度亦明显高于健康对照者(978.1±864.4 ng/ml vs 274.3±109.6ng/ml,p<0.001),诊断效能较高(ROC曲线下面积分别为0.913)。免疫组织化学染色发现,GS在肝癌组织中的表达明显高于癌旁组织(p<0.01),结合临床病理学特征分析发现:肝癌组织中GS表达量与病人临床病理学特征之间无明显相关性;预后分析发现:在中分化肝癌中,肝癌组织GS表达量(p=0.045)及血管侵犯(p=0.003)是影响病人无瘤生存时间的独立危险因素,同时,Kaplan-Meier分析发现GS高表达及存在血管侵犯的病人无瘤生存率明显低于对照组(术后三年无瘤生存率分别为42%vs 18%,p=0.001;36%vs 8%,p<0.001),并且双指标联合分析可以提高预后评判价值(p<0.001)。基于TCGA数据库提取建立的肝癌队列分析发现:肝癌组织中GS-mRNA的表达量明显高于癌旁组织(p<0.01),结合病人预后进行分析发现在乙肝相关肝癌病人中,GS-mRNA高表达病人术后总体生存率更低(术后五年生存率61%vs 43%,p=0.014);在酒精性肝病相关肝癌病人中,亦得到同样的结论(术后五年生存率53%vs 28%,p<0.001)。2.细胞增殖实验发现,在不含谷氨酰胺的培养体系中,GS沉默明显抑制肝癌细胞增殖(p<0.001)及克隆形成(p<0.01),GS过表达明显增强肝癌细胞增殖(p<0.001)及克隆形成能力(p<0.001),Western blot实验发现在该培养体系中沉默 GS 会减少 p-mTOR-S2448、p-S6-S235/236 和 p-S6-S240/244,而过表达 GS 会增加p-mTOR-S2448、p-S6-S235/236和p-S6-S240/244;而在含谷氨酰胺的培养体系中,GS对肝癌细胞增殖及克隆形成无明显影响,Western blot实验发现在该培养体系中沉默或过表达GS对mTOR/p-S6通路蛋白均无影响。细胞迁移实验发现,沉默GS表达会抑制肝癌细胞迁移能力(p<0.01),而过表达GS会增加肝癌细胞迁移能力(p<0.01)。Western blot实验发现沉默GS表达会明显降低N-钙黏蛋白(N-cadherin,N-cad)表达量同时增加E-钙黏蛋白(E-cadherin,E-cad)的表达量,相反,过表达GS可增加N-钙黏蛋白的表达量同时降低E-钙黏蛋白的表达量。裸鼠肝癌肺转移及肝转移模型发现,GS高表达会增强肝癌细胞在裸鼠体内的转移能力(肺转移率50%vs 0%)。肝癌病人肿瘤组织免疫组化染色发现GS与p-S6-S235/236及GS与p-S6-S240/244均呈明显正相关。研究结论:1.GS可能在肝癌的发生发展中发挥重要作用;2.GS是肝癌诊断、预后预测的潜在分子标记物;3.GS通过调控mTOR/p-S6通路影响肝癌细胞增殖,通过调控上皮间质转化影响肝癌细胞侵袭;4.GS可能是防治肝癌恶性增殖及转移的潜在分子靶点。