论文部分内容阅读
干旱是限制植物生长发育和作物产量的主要非生物胁迫因素之一,植物在长期进化过程中形成了多种应答干旱胁迫的机制。干旱胁迫时通过调控气孔保卫细胞的生理生化特性来改变气孔的传导度和开度,进而调控植株的蒸腾作用减少水分丧失是植物应答干旱胁迫的一种重要机制。质膜H+-ATPase在高等植物的生命活动中有主宰酶的作用,调控许多重要的生理过程。质膜H+-ATPase也是调控气孔开度的关键酶,其泵H+作用能引起气孔开放,因此在水分胁迫下质膜H+-ATPase活性变化是植物适应水分胁迫的重要机制之一。14-3-3蛋白是在真核细胞中发现的一类高度保守的调控蛋白,通过与磷酸化质膜H+-ATPase的C末端结合而增加其活性,而质膜H+-ATP酶的磷酸化水平受许多环境因素的调节。大豆是典型的C3植物,干旱胁迫是制约大豆产量的主要原因之一,本论文用PEG模拟干旱胁迫处理两个大豆栽培种(一种为黄皮大豆简称黄豆(YS),另一种黑皮大豆简称黑豆(BS)),研究YS和BS叶片14-3-3蛋白和质膜H+-ATPase应答PEG模拟干旱胁迫的分子机理,主要取得以下研究结果：1.在水培条件下用聚乙二醇(PEG)模拟干旱胁迫处理YS和BS,分析大豆叶片生理特性与14-3-3蛋白(SGF14)及质膜H+-ATP酶的表达、互作及活性的相关性。结果发现在2%、5%和10%PEG处理条件下,随处理浓度和时间的增加,两种大豆植株失水率上升,叶片蒸腾速率降低,气孔传导率下降。在所有相同处理条件下,黄豆植株失水率小于黑豆,而叶片蒸腾速率和气孔传导率下降幅度大于黑豆,说明黄豆的耐旱性比黑豆强。在相同处理下黄豆叶片可溶性蛋白、可溶性糖含量高于黑豆,而黑豆叶片中游离脯氨酸含量高于黄豆；在抗氧化酶体系中,黄豆叶片CAT活性下降速度快于黑豆,使其叶片中H202含量高于黑豆。用RT-PCR分析两种大豆叶片中16种不同亚型SGF14基因和质膜H+-ATP酶(GHA2)转录水平的变化,结果说明PEG胁迫对YS和BS叶片中GHA2的转录都有诱导作用；YS叶片大部分SGF14亚型基因本底的转录水平都高于BS,PEG的胁迫仅对YS叶片中5种14-3-3基因(SGF14e、SGF14d、SGF14i、SGF14n、 SGF14p)的转录有显著的诱导作用,对BS叶片中所有SGF14亚型的转录都有诱导作用。干旱胁迫下黄豆叶片质膜H+-ATPase磷酸化水平及其与14-3-3蛋白的结合受到的抑制作用比黑豆强,黄豆叶片质膜H+-ATPase和H+泵活性也比黑豆叶片低,黄豆叶片气孔开度小于黑豆,叶片蒸腾速率和气孔传导率也就低于黑豆,说明这是黄豆耐旱性比黑豆强的一个重要机制。2.很多研究结果说明脯氨酸(Pro)、赤霉素(GA)和甜菜碱能增加植物的吸水能力和耐干旱性。本研究在5%PEG模拟干旱胁迫下分别添加Pro、GA和甜菜碱处理两种大豆,考察Pro、GA和甜菜碱缓解植物干旱胁迫作用与叶片质膜H+-ATPase活性的相关性。结果说明与单独的PEG处理相比,在PEG胁迫下添加Pro、GA和甜菜碱都减少了两种大豆植株的失水率,证实添加Pro、GA和甜菜碱都具有缓解PEG模拟干旱胁迫两种大豆的作用。然而在PEG胁迫下添加Pro、GA和甜菜碱都增加了两种大豆的气孔传导率和蒸腾速率,证实它们缓解PEG胁迫并非通过减少叶片的蒸腾作用而是通过增加大豆的吸水能力实现。免疫共沉淀(COIP)分析结果表明在PEG胁迫下添加Pro、GA和甜菜碱不改变两种大豆叶片中质膜H+-ATPase的磷酸化水平及其与14-3-3蛋白的结合能力,质膜H+-ATPase和H+-泵活性与单独的PEG处理相比没有差异,叶片气孔开度显著增加,说明质膜H+-ATPase与14-3-3蛋白的相互作用并不参与Pro、GA和甜菜碱缓解PEG模拟干旱胁迫两种大豆的作用。3.腺苷-5’-单磷酸(AMP)和钒酸盐(VA)都是质膜H+-ATPase的抑制剂,前者能够抑制14-3-3蛋白与磷酸化质膜H+-ATPase的结合而降低质膜H+-ATPase的活性；而IAA和MgCl2是质膜H+-ATPase的激活剂,能够增强质膜H+-ATPase的磷酸化作用并促进14-3-3蛋白与磷酸化质膜H+-ATPase的结合,提高质膜H+-ATPase活性。为了进一步考察在PEG模拟干旱胁迫下两种大豆叶片中质膜H+-ATPase与14-3-3蛋白对气孔生理特性的调控作用,在5%的PEG模拟干旱胁迫下添加AMP和VA处理BS,结果发现与单独的PEG处理相比AMP和VA的存在使BS植株失水率分别减少12%和14%,同时叶片蒸腾速率和气孔传导率均显著下降。COIP分析结果表明BS质膜H+-ATPase磷酸化及其与14-3-3蛋白的相互作用水平降低,酶活性和H+-泵活性下降,气孔开度减小,说明AMP和VA通过抑制质膜H+-ATPase与14-3-3蛋白的相互作用来降低气孔开度和叶片的蒸腾作用,缓解PEG的干旱胁迫。用IAA和MgCl2处理YS后,与单独PEG处理对比,IAA和MgCl2存在使植株失水率升高分别升高约23%和17.2%,叶片蒸腾速率和气孔传导率也随之升高。COIP分析结果表明质膜H+-ATPase磷酸化水平升高,与14-3-3蛋白的结合能力增强,酶活性和H+泵活性上升,叶片气孔开度增大,说明IAA和MgCl2通过增加质膜H+-ATPase与14-3-3蛋白的相互作用来增加气孔开度和叶片的蒸腾作用,加剧PEG干旱胁迫的效果。这些结果说明在PEG模拟干旱胁迫下质膜H+-ATPase与14-3-3蛋白对两种大豆叶片中气孔生理特性有重要的调控作用。在干旱胁迫外源施用AMP和VA可增加大豆的耐旱能力。4.最近的研究表明H202能抑制质膜H+-ATPase的磷酸化及其与14-3-3蛋白的结合,从而降低H+-ATPase活性并减少离体蚕豆表达条的气孔开度。抗坏血酸(ASA)是一种常用的H202清除剂,H202的产生依赖于脱落酸(ABA),钨酸钠是ABA合成抑制剂,钨酸钠的存在也抑制H2O2的产生。在PEG胁迫下YS叶片中产生的H202含量高于BS,为了解在PEG胁迫下H202是否参与BS和YS叶片质膜H+-ATPase活性的调控,在5%PEG干旱胁迫下添加ASA和钨酸钠处理YS,结果使YS植株失水率分别上升17.4%和15.7%,叶片蒸腾速率分别上升19.2%和9.1%,气孔传导率分别上升17.3%和8.7%,YS叶片H202的含量下降。COIP分析结果表明添加ASA和钨酸钠使YS叶片质膜H+-ATPase磷酸化水平升高,质膜H+-ATPase与14-3-3蛋白的相互作用增强,酶活性和H+-泵活性上升,气孔开度增大。在5%的PEG胁迫下添加H202处理BS,结果使BS植株失水率下降26.3%,叶片蒸腾速率和气孔传导率分别下降约8.1%和11.2%,COIP分析结果表明添加H202使BS叶片质膜H+-ATPase磷酸化水平下降,同时与14-3-3蛋白的结合减弱,酶活性和H+泵活性降低,气孔开度减小。这些结果证实在PEG胁迫下H202参与BS和YS叶片质膜H+-ATPase活性的调控,在干旱胁迫下施用外源H202提高大豆耐旱能力。