作为世界三大传染病之一,疟疾仍是危害人类健康的重大疾病。2019年WHO发布的《世界疟疾报告》中显示,恶性疟原虫和间日疟原虫是世界范围内较为常见的疟原虫,在疟疾高发的非洲地区由恶性疟原虫引起的疟疾发病病例占病例总数的99.7%。可见,合理的解决疟疾问题,仍是人类需要面临的重大挑战。疟原虫是疟疾的病原体,能够寄生于按蚊和脊椎动物中,寄生于人体红细胞内的阶段称作红内期。红内期疟原虫主要以糖酵解作为主要的供能方式,由氧化磷酸化途径的产能较少。红内期疟原虫通过增加自身糖酵解途径相关酶的蛋白表达以及改变红细胞膜的通透性来满足红内期阶段对葡萄糖的大量需求。疟原虫与肿瘤细胞相似,对能量的快速需求使其更偏向于反应过程较短且在胞浆中完成的糖酵解方式,糖酵解途径可以在短时间内提供能量。虽然氧化磷酸酸化途径供能较少,但是疟原虫的线粒体却在整个传播过程中发挥着至关重要的作用。对于目前的国际一线抗疟药物青蒿素类化合物而言,其抗疟机制仍是众说纷纭,但是众多假说中都提到了线粒体的参与作用,更有一种假说认为线粒体激活了青蒿素进而发挥抗疟作用。所以,线粒体作为抗疟药物可能作用的潜在靶点,本文旨在寻找一种能够测量疟原虫能量代谢途径的方法,用于考察红内期疟原虫有氧呼吸和糖酵解的作用。目前,细胞外通量分析已经成为检测细胞中生物能的一种主流方法,能够在不受外界环境干扰和不破坏细胞自身结构的前提下,实时监测细胞的能量代谢。Seahorse XF分析仪能够同时对细胞的有氧呼吸和糖酵解进行检测,并将检测得到的氧浓度与pH值转化为相应的OCR和ECAR值。本文所选用的Seahorse XFe96分析仪可以一次性测量多达96个样本的能量变化,其高通量的特点克服了传统使用Clark氧电极的局限性,使测量变得更高效,更灵活且便于重复。Seahorse XF分析多用于肿瘤细胞、成纤维细胞、神经元细胞和T细胞等细胞的分析,对于红细胞和红内期疟原虫的分析较少,缺乏较为成熟的方法。因此,本文综合现有理论和方法并根据红细胞和疟原虫自身的特点,对多种影响因素进行筛选与确定,最终建立了一种可实时原位检测红内期疟原虫能量代谢的新方法。并利用所建立的方法对现有的国际一线抗疟药物、在研药物以及相关抑制剂化合物作用于疟原虫的能量代谢进行考察,分别评价各类化合物对红内期疟原虫线粒体有氧呼吸和糖酵解的影响,为后续红内期疟原虫的深入研究提供基础数据。1.基于Seahorse XF分析仪——实时原位检测红内期恶性疟原虫能量代谢方法的建立体外培养P.falciparum 3D7,经多次同步化处理后培养出虫期较一致的滋养体期疟原虫,利用磁珠分选的磁性原理分离富集高纯度的滋养体期疟原虫,流式细胞仪检测富集纯度可达90.55%。富集的滋养体期疟原虫用于SeahorseXF分析的上机检测。首先对4种粘附剂进行筛选,初步确定Poly、C1010和Rat-0.12共3种粘附剂进行后续同细胞密度的同步筛选。在粘附剂和细胞密度同步筛选的过程中,分别优化了检测程序和上机培养基成分。检测程序由原来初始的3个Cycle增加至4个Cycle并取消了仪器原有的Mix过程,为了保证检测数值能在仪器的最适检测范围20-160pmol/min,初步将仪器建议的上机检测培养基AM改为与疟原虫生长相关的UB培养基。上机结果显示,细胞密度过高（9-10M）会导致疟原虫自身营养不足,活性降低最后死亡,检测的OCR值小于20pmol/min;低密度下,因疟原虫单位个数较少而不能满足仪器的最适检测范围,OCR值仅为20pmol/min左右,故综合后两次实验结果最终确定疟原虫最适的细胞密度为5M。然后在5M的最适细胞密度下寻找最佳的粘附剂,通过上清细胞个数和OCR值双重指标最终确定Poly作为上机选用的粘附剂,此时OCR值最大可达到78.18 pmol/min。随后采用最佳粘附剂Poly和最适细胞密度5M进行后续指标的筛选。在筛选粘附剂和细胞密度条件时,对上机培养基进行了初步的优化,所以又对上机检测培养基进行了详细的筛选。将包括疟原虫生长培养基在内的4种培养基进行了成分的比较,发现AM与其他3种培养基相比,缺少了部分缓冲成分,不适合疟原虫生长。上机整个过程的pH值比较发现,UB和UBP均能够维持疟原虫上机过程的生长环境,表现为疟原虫的活性状态较好,OCR值也相应较高。上机OCR值比较可知,AM作为上机培养基时整个检测过程的OCR值均在20pmol/min以下,UB和UBP的初始OCR值均为40pmol/min左右,检测过程中的OCR值均有上升趋势,其中UBP作为上机检测培养基时OCR值的上升趋势更大。结合上机前后pH值和OCR值响应的两个因素,最终确定UBP作为疟原虫上机检测的培养基。确定了粘附剂、细胞密度和上机检测培养基等几个条件后,对线粒体压力测试试剂盒中的Oligo和FCCP两种工具药物浓度进行筛选。结果显示,Oligo在低浓度（0-5μM）时不会降低体系的OCR值,系统无响应;逐渐增加Oligo的浓度后,在10 μM以上的浓度时体系的OCR值有降低趋势,10-15 μM浓度的效果相近。综合系统OCR值的响应程度和工具药物的作用趋势,得到两组较为合适的浓度,分别是Oligo浓度为10 μM、FCCP浓度为0.5μM和Oligo浓度为12.5 μM、FCCP浓度为1μM。将两组浓度再进一步比较后,最终选择Oligo浓度为10 μM、FCCP浓度为0.5μM的工具药组合作为疟原虫上机检测的最适工具药浓度。将粘附剂、细胞密度、上机检测培养基以及线粒体复合物的抑制剂等条件筛选确定后,编写了适合红内期疟原虫检测的一般程序,并绘制了P.falciparum 3D7正常情况下的线粒体呼吸图。2.同等实验条件下抗疟药物对恶性疟原虫增殖的影响对包含青蒿素及其衍生物在内的10大类别国际一线抗疟药物以及3大类别国际在研药物进行同一实验条件下的抗疟活性评价,得到24个化合物的IC50值。实验结果显示,对于国际一线抗疟药物来说,大部分药物的IC50值为nM级别,仅有少数类别的药物IC50值为μM级别。抗疟活性优于ART的药物有:CQ（IC50=14.10 nM）,Amo（IC50=4.48 nM）,Mef（IC50=10.50 nM）,Lum（IC50=11.22nM）,ARE（IC50=7.88 nM）,ARM（IC50=5.47nM）,ATS（IC50=5.00 nM）,DHA（IC50=3.80nM）,Ato（IC50=0.37nM）,Mal（IC50=4.27 nM）。其中Ato作为已知的ETC复合物Ⅲ的抑制剂其药效更是优于DHA。另外,3种在研药物均具有较好的抗疟活性,其IC50值低于大多数国际一线抗疟药物,IC50值分别为:DSM（IC50=7.84nM）,Cip（IC50=1.19nM）,Blue（IC50=5.93 nM）,3种药物的抗疟活性均优于ART,其中Cip的药效优于DHA。后续实验剔除IC50值较大的2种抗疟药物Sul和Cli,将其余的抗疟药物在同等IC50水平下进行考察。3.抗疟药物和相关抑制剂对恶性疟原虫线粒体呼吸的影响选择线粒体压力测试试剂盒并利用已建立的方法对P.falciparum3D7线粒体不同时刻的生物能进行评价。绘制折线图直观的反应药物对疟原虫的实时影响,结果显示,青蒿素及其衍生物无论是低剂量还是高剂量均对P.falciparum3D7线粒体有氧呼吸无明显的影响。绘制能够代表线粒体功能的柱状图显示,ARM在增加线粒体的最大呼吸和质子漏上具有显著性（P≤0.001）,在某种程度上促进了线粒体呼吸,但是并没有从实质上破坏线粒体的ETC。对抗疟药物和在研药物的考察结果显示,13大类别共22种化合物在5×IC50和10×IC50两种浓度下,多数抗疟药物对P.falciparum 3D7线粒体有氧呼吸无明显影响,并未破坏疟原虫线粒体ETC,青蒿素及其衍生物的结果与上述单独考察的结果相同。青蒿素及其衍生物随着药物剂量的增加,对提高线粒体最大呼吸的显著性增强。CQ和QN,在10×IC50浓度时对增加线粒体质子漏和降低储备呼吸量的水平具有显著性（P≤0.001）,但整个过程并未完全破坏疟原虫线粒体ETC的功能。Dap随着药物剂量的增加,对线粒体的抑制作用增强,10×IC50浓度下能够造成对线粒体呼吸的抑制,加药后能够显著增加线粒体的基础呼吸水平（P≤0.0001）。Azy随着药物剂量的增加,对线粒体的抑制效果增强,10×IC50浓度下能够显著降低线粒体的最大呼吸（P≤0.001）。Pro仅在高剂量10×IC50浓度下对线粒体呼吸有抑制作用,能够显著降低线粒体的最大呼吸（P≤0.0001）。Ato作为线粒体ETC复合物Ⅲ的抑制剂,在5×IC50和10×IC50浓度下,均能对曲线有明显的改变,表现为OCR值降低,耗氧率下降,能够明显抑制线粒体ETC,抑制疟原虫线粒体有氧呼吸。DSM和Cip在5×IC50浓度时对增加线粒体最大呼吸有显著性（P≤0.01）,Blue在10×IC50浓度时能够显著降低线粒体的最大呼吸（P≤ 0.01）,但是3种在研药物并未完全破坏疟原虫线粒体ETC的功能。所以在本实验条件方法及所选浓度下,除个别药物外,多数抗疟药物对P.falciparum 3D7线粒体有氧呼吸均无明显影响,结合上述实验结果,推测多数抗疟药物在发挥抗疟作用时并不是最先启动线粒体的死亡机制,也反映出疟原虫死亡的过程中线粒体在其中应该不是早期事件。随后,对铁死亡诱导剂和与铁离子转运相关的离子通道抑制剂进行考察,结果显示,10×IC50浓度下Era和Sor能够抑制疟原虫的线粒体呼吸,RSL3对疟原虫线粒体的抑制作用不明显,但3种铁死亡诱导剂均能显著降低线粒体的基础呼吸和减少质子的泄漏（P≤0.01）。20×IC50浓度的离子通道抑制剂作用于疟原虫后,Baf和EIPA对P.falciparum 3D7线粒体有氧呼吸无明显的影响,Ami对P.falciparum 3D7线粒体有氧呼吸有明显的抑制作用。DHA与Ami、Baf和EIPA共3个离子通道抑制剂分别联用的结果显示,联用后三组药物均对P.falciparum 3D7线粒体有氧呼吸有抑制作用,可见DHA与离子通道抑制剂的药物联用对疟原虫线粒体的抑制效果有一定的协同作用。4.青蒿素类化合物和铁死亡诱导剂对恶性疟原虫糖酵解的影响选择糖酵解速率分析试剂盒并利用已建立的方法对P.falciparum 3D7糖酵解进行评价。为了排除RBC对疟原虫糖酵解检测造成影响,所以最先对RBC和iRBC的糖酵解进行考察。结果显示,正常情况下iRBC糖酵解的ECAR值在50-70左右,RBC糖酵解的ECAR值则在基线附近,iRBC的糖酵解强度大约是RBC的50-70倍。随后对青蒿素及其衍生物的考察结果显示,5种化合物在高浓度下对糖酵解仅有轻微的抑制趋势,抑制效果不明显,可见在本实验条件方法及所选浓度下,青蒿素类化合物对P.falciparum3D7糖酵解无明显的影响。能够反应糖酵解贡献率的PER百分比显示,ART不同剂量组和空白组的糖酵解PER与基础PER的百分比均能达到96%以上,线粒体OCR值与糖酵解PER的比值均小于0.1。说明红内期疟原虫是以糖酵解作为其主要的供能方式,由线粒体产生的供能少之又少。此外,对铁死亡诱导剂的考察结果显示,由于系统的检测时间过长导致了疟原虫的自身活性降低,空白组的曲线呈逐渐下降的趋势,所以提示在使用仪器分析红内期疟原虫能量代谢的途径时,系统整体的检测时间不宜过长,最好控制在3h以内,以保证疟原虫自身的活性和系统检测的准确性,因此铁死亡诱导剂对于P.falciparum 3D7糖酵解的影响有待进一步考察。