MAPK14和CDC25B在肾透明细胞癌中作用机制的研究

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目的:肾细胞癌的发病率在癌症中占第九位,是全球主要的公共卫生问题。肾癌的发生和转移机制极为复杂,不仅与基因突变有关,而且与肿瘤的抑制和激活途径的失衡有关。肾透明细胞癌是肾癌中最常见和最具侵袭性的亚型,约占所有病例的70%。手术仍是局部肾透明细胞癌患者的主要治疗方法。尽管近年来转移性肾透明细胞癌的靶向治疗取得了很大进展,但无进展生存率仍有待提高。因此,有必要识别肾透明细胞癌的有效生物标志物和新的治疗靶点,以改善患者的预后。MAPK14基因在许多肿瘤中高表达,其在肾透明细胞癌中的生物学功能尚未阐明。本研究探讨了MAPK14基因在肾透明细胞癌中的生物学功能以及对相关蛋白的影响,为探索新的治疗方法提供依据。研究方法:1、MAPK14、P-MAPK14和CDC25B在肾透明细胞癌与癌旁组织中的表达及相关性分析采用TCGA(https://www.cancer.gov/about-cancer)数据库分析MAPK14和CDC25B在72对肾透明细胞癌组织中的转录水平。通过Western Blot检测66对肾透明细胞癌组织和相匹配的癌旁组织中MAPK14、P-MAPK14和CDC25B的蛋白表达水平。2、分析MAPK14、P-MAPK14与CDC25B相互作用的机制采用qRT-PCR和Western Blot检测MAPK14 siRNA和CDC25B siRNA的转染效率以及下游基因mRNA和蛋白的表达水平变化。采用免疫共沉淀实验检测P-MAPK14是否与CDC25B蛋白相互结合。当过表达CDC25B时,通过Western Blot技术检测MAPK14以及P-MAPK14蛋白水平的变化。3、检测CDC25B过表达肾透明细胞癌细胞及对照组中MAPK14下调后细胞功能变化用肾透明细胞癌细胞系ACHN和CAKI-1建立CDC25B过表达的细胞系,分别在过表达CDC25B基因的细胞及对照组中采用EdU实验检测MAPK14下调后细胞增殖能力变化,采用Transwell实验检测MAPK14下调后细胞迁移能力变化。4、观察稳定下调MAPK14以及上调CDC25B后裸鼠体内肿瘤生长的变化应用裸鼠异种移植瘤实验,观察肾透明细胞癌ACHN中下调MAPK14蛋白以及高表达CDC25B蛋白对肿瘤生长的影响。5、P-MAPK14相关基因分析通过疾病网络开放资源数据库(http://disnor.uniroma2.it/)分析TCGA数据库中72对肾透明细胞癌和癌旁组织中可能磷酸化MAPK14或者抑制P-MAPK14去磷酸化的基因表达水平。结果:1、TCGA数据库转录水平分析显示MAPK14在肾透明细胞癌和癌旁组织的表达没有显著性差异,而CDC25B的转录水平在癌组织中明显高于癌旁组织。Western Blot检测显示在肾透明细胞癌和癌旁组织中MAPK14蛋白表达水平没有显著性差异,而肾透明细胞癌中P-MAPK14蛋白水平显著高于癌旁组织。同样,肾透明细胞癌中CDC25B的蛋白水平显著高于癌旁组织。相关性分析结果显示P-MAPK14和CDC25B蛋白水平显著相关。2、qRT-PCR和Western Blot检测显示MAPK14 siRNA和CDC25B siRNA均可降低目的基因表达。MAPK14基因下调后P-MAPK14和CDC25B的蛋白表达显著减少,而CDC25B的下游基因CDC2的磷酸化蛋白表达水平增高。沉默CDC25B蛋白后CDC2的磷酸化蛋白水平也增高。免疫共沉淀结果显示PMAPK14能与CDC25B结合,CDC25B过表达不影响MAPK14和P-MAPK14的蛋白水平。3、EdU结果显示MAPK14下调后细胞的增殖能显著下降,Transwell结果证实了细胞缺少MAPK14蛋白后其迁移能力降低。但是在稳定过表达CDC25B的细胞系中下调MAPK14后并没有使细胞的增殖和迁移能力显著降低。4、异种移植瘤实验表明MAPK14下调后肿瘤的生长减慢,而过表达CDC25B能够促进肿瘤的生长。5、疾病网络的开放资源网站分析结果显示MAP2K3和MAP2K6可能参与MAPK14的翻译后修饰,PKN1、PTPN7、DUSP1、DUSP4、DUSP7、DUSP10、PTPRR,以及PPM1D可以维持MAPK14的磷酸化。结论:P-MAPK14与CDC25B蛋白在肾透明细胞癌组织中高表达,PMAPK14能够与CDC25B蛋白在细胞内结合,并能维持其稳定性。MAPK14和P-MAPK14下调可以抑制肾透明细胞癌细胞的增殖和迁移能力,与CDC25B蛋白下调有关。
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