麦长管蚜(Sitobion avenae)是世界性的重要农业害虫,在我国各小麦产区均有分布,是害虫优势种之一。麦长管蚜具有寡食性、适应性强、生活史复杂、具迁飞能力,以及遗传多样性、害虫种群易分化等特点,近年的研究发现该蚜虫还有生物型分化的现象。蚜虫与寄主植物的长期协同进化过程中,寄主植物形成了一套防御机制来适应外界生物的胁迫,蛋白酶抑制剂是植物防御相关蛋白,可通过降低昆虫肠道蛋白酶活性,干扰昆虫代谢系统,抑制其正常生长发育。蚜虫也相应形成一套适应性机制,生物型的分化是重要适应性机制之一。因此,探讨植物蛋白酶抑制剂和麦长管蚜生物型分化之间的关系,对发展小麦蚜虫防治新策略具理论和实践价值。本文从蛋白酶抑制剂与不同麦长管蚜生物型相互作用的角度出发,较为深入地探讨了植物源蛋白酶抑制剂在昆虫生物型分化中的作用。本文克隆了不同小麦品系(即铭贤169、西农979、186.TM12-34、中4无芒、矮抗58)中蛋白酶抑制剂过程如下:PCR结果表明,半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因WC1、WT005＿K06、WC4都具有明亮条带;成功构建这些基因的克隆载体,并在大肠杆菌感受态细胞(DH5α)中表达;经测序并与NCBI中已发布的小麦蛋白酶抑制剂基因序列进行比对,获取了正确基因序列。q RT-PCR实验观察到WC1、WT005＿K06、WC4基因表达量在各小麦品系之间均无显著差异,但WT005＿K06表达量是WC1、WC4基因表达量的几百倍之多,说明这些组成型防御蛋白中WT005＿K06的作用可能最强,但WC1、WC4能否被蚜虫取食诱导表达尚需实验验证。为了进一步研究小麦蛋白酶抑制剂与麦长管蚜生物型分化之间的关系,对小麦蛋白酶抑制剂进行了表达和纯化。采用原核表达系统,成功构建PET-28a(+)-WC1、PET-28a(+)-WT005＿K06、PET-28a(+)-WC4表达载体。经预实验,获取了最佳IPTG诱导浓度和最适诱导温度,从而保证了基因在大肠杆菌感受态细胞BL21中高效表达。表达结果表明,3种重组蛋白在上清液和沉淀中均表达,其中上清液表达量较高。筛选了WC1、WT005＿K06、WC4蛋白的最适咪唑洗脱浓度,提高了蛋白纯化效率。比较了不同生物型麦长管蚜总蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶的活性,结果发现不同生物型蛋白酶活性之间均存在显著差异:6种生物型总蛋白酶活性最高的是生物型ZMB54,其次是生物型HM29、ZYB34,而生物型HMB7总蛋白酶活性最低;生物型HM29的半胱氨酸蛋白酶活性最高,生物型HMB7和ZY2的半胱氨酸蛋白酶活性最低。比较了WC1、WT005＿K06、WC4重组蛋白对不同生物型蛋白酶的抑制作用,发现WT005＿K06对生物型ZYB34抑制作用最强;WC1对生物型HM29和ZYB34抑制作用最大;WC4对生物型HMB7具有较大抑制作用。因此,蛋白酶抑制剂与麦长管蚜生物型分化可能存在较为密切的关系。通过人工饲料饲喂实验观察重组蛋白对不同麦长管蚜生物型生长发育的抑制作用。结果表明:麦长管蚜取食24 h后,重组蛋白酶抑制剂对不同生物型存活影响很小;麦长管蚜取食72 h后,重组蛋白酶抑制剂的作用较为显著,蚜虫存活数量普遍降低。综上所述,本文克隆了小麦半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因,体外表达了半胱氨酸蛋白酶抑制剂蛋白;确证了半胱氨酸蛋白酶抑制剂对蚜虫体内蛋白酶的抑制作用,发现他们对不同生物型麦长管蚜半胱氨酸蛋白酶具不同程度的抑制作用;而且半胱氨酸蛋白酶抑制剂能显著影响麦长管蚜的存活,对不同生物型麦长管蚜的作用具有明显区别。这些结果对于理解蛋白酶抑制剂的抗蚜作用,弄清蛋白酶抑制剂与蚜虫生物型分化之间的关系,以及开发抗压新品种等具有重要理论和实践意义。