骨性关节炎和创伤是临床上造成关节软骨损伤的常见原因，随着现代社会人口老龄化及经济的发展，关节软骨损伤的发生明显增加，损伤后的自身修复能力低下，常引起严重的关节功能障碍。目前临床有多种治疗方法，但效果均不能令人满意，组织工程软骨的发展为关节软骨缺损的修复带来了光明前景。但新生软骨与关节下骨及与周围软骨的结合问题有待解决。 本实验拟对新型双向三维支架材料胶原复合梯度磷酸三钙在体外与软骨细胞的相容性和吸附性进行研究，评价其作为软骨组织工程支架的可行性。并用新型双向三维可降解生物活性材料--胶原复合梯度磷酸三钙对动物关节软骨损伤缺损进行修复，以促使其软骨自身再生，以期获得高质量、稳定结合的关节软骨。 材料与方法： 1.实验主要试剂 A.特殊组化染色试剂：甲苯胺蓝 B.免疫组化试剂： CollagenlIAb单克隆抗体SABC试剂盒：即用型DAB显色试剂盒 C.细胞分离及培养试剂： Dulbecco改良DMEM/HamF12混合培养基胎牛血清II型胶原酶链球菌蛋白酶 2.材料 (1).动物来源： 6～8周龄新西兰大白兔，体重2～2.5kg，雌雄不限，购于岭南试验动物中心。 (2).胶原复合梯度磷酸三钙支架材料： 支架材料由华南理工大学生物材料研究所研制提供，I型胶原为基材，与具有良好生物活性的磷酸三钙粉体共混交联，经冷冻干燥成型。其中胶原为支架主体，材料上面1mm为纯胶原，以下磷酸三钙粉体呈梯度分布，浓度由下而上递减。将制备好的柱状胶原磷酸三钙复合材料冷冻干燥后，经环氧乙烷气体消毒后备用。 3.实验方法 (1)软骨细胞的提取及培养 大白兔空气栓塞处死后。在无菌条件下用手术刀取出双侧膝关节软骨，切成约1mm3的碎片。用酶消化法提取兔关节软骨细胞。加入原代软骨细胞培养液DMEM/HamF12进行细胞培养，并行倒置显微镜观察。 (2)软骨细胞与支架材料复合培养 将胶原复合梯度磷酸三钙支架材料修剪成直径4mm、厚1mm圆盘状，置入6孔培养板，取第3代软骨细胞接种于支架材料内，进行复合培养。 (3)软骨细胞与支架材料相容性观察 培养3，7d后，分别取出复合细胞的支架材料常规行HE染色，II型胶原免疫组织化学染色。 (4)扫描电镜观察细胞在材料上的黏附状态 复合细胞的支架培养3，7d后以2.5％的戊二醛固定，梯度酒精脱水，叔丁醇置换，真空干燥，离子喷射仪喷金，扫描电镜下观察细胞在材料表面及内部的黏附形态。 (5)创伤性关节软骨缺损动物模型制备 鲁米那静脉麻醉实验动物，取膝关节外侧切口，暴露股骨外侧髁关节面，在其股骨外侧髁关节面用电钻钻出直径4mm，深3mm的圆柱状缺损，形成创伤性关节软骨缺损动物模型。 (6)Co/TCP复合材料修复软骨的动物实验 30只大白兔双膝人为形成关节软骨缺损，选择右膝为实验组，嵌入大小、形状与缺损相似的Col/TCP；左侧为对照组，缺损不予处理，缝合关节囊和皮肤。术后膝关节不固定，置笼内自由活动。于术后4、6、8、12和24周空气栓塞法各处死6只分别取材。 (7)再生软骨组织的检测 1)大体观察术后观察动物活动、步态、伤口愈合及缺损修复情况、膝关节有无挛缩、粘连和新生物、修复组织的平整性、光泽度及与周围组织的结合情况。 2)组织学观察取双膝股骨外髁标本，4％多聚甲醛固定，EDTA脱钙，常规石蜡包埋切片，甲苯胺蓝染色和HE染色行组织学观察，并采用盲法对各标本进行组织学评分，评分标准采用Wakitanifa法。 3)II型胶原免疫组织化学染色常规石蜡切片，按免疫组织化学试剂盒说明进行操作，DAB显色。通过Photoshop7.0计算图像平均像素密度，取每张切片修复组织与正常关节软骨像素强度比值作为统计指标。行统计学分析。 4)透射电镜观察实验组和对照组取缺损区表层新生组织，2.5％戊二醛及1％OsO4双固定，常规脱水包埋切片、铅铀双染，在透射电镜下观察。 结果： 1.材料的形态和孔隙率 扫描电镜可以观察到支架材料具有疏松多孔结构，孔隙结构规则，孔径约100～150μm，材料内部孔与孔之间贯通良好通过排水法测定材料的孔隙率大于90％。 2.倒置相差显微镜观察 倒置显微镜观察：原代软骨细胞，悬浮于培养液中，呈球形。4d后细胞贴附着尼龙纱巾生长，形状不一；还可见细胞贴壁生长，呈多边形，可见细胞核分裂相，细胞增殖极缓慢。经1～3代传代培养，细胞体积增大突起增多，可见细胞聚集成簇，有核分裂相的细胞较少。4或5代细胞呈去分化表现，细胞变成长梭形可沿一个方向排列生长，呈纤维细胞样，核分裂相仍少见，胞浆中仍有较多颗粒，细胞汇合、相互接触时不恢复原来形态。 3.软骨细胞复合支架材料组织学观察 1)HE染色 支架材料复合软骨细胞培养3天后，孔隙内可见大量细胞，多数细胞呈多角形或者不规则形，少数呈短梭形，于细胞周围间隙可见基质成分。支架材料复合软骨细胞培养7天细胞广泛分布于支架材料孔隙，呈梭形或圆形，核呈圆形或椭圆形，胞质透亮均匀，细胞核轮廓清楚。 2)免疫组织化学染色 支架材料复合软骨细胞培养3天后，材料孔隙中可见大量复合于支架材料上的细胞，胞浆内可见棕黄色颗粒，细胞周围出现黄染区。支架材料复合软骨细胞培养7天胞浆及细胞周围棕黄色更加明显。 4.胶原复合梯度磷酸三钙支架材料与软骨细胞相容性的观察：细胞基质材料体外培养3天后，扫描电镜观察见大量细胞粘附于支架材料上并向深部孔隙长入，已开始分泌出较多胶原纤维，7天后细胞成团状，互相有纤维连接。 5.胶原复合梯度磷酸三钙支架材料修复兔关节软骨的大体观察 术后前3d，所有实验兔稍跛行，双膝活动少，随后活动逐渐增加；2周后行走如常，全部术膝伤口愈合良好，无感染表现。 实验组术后4周缺损区由白色组织完全充填，表面较光滑，有光泽，与正常软骨的界线模糊；术后6周修复组织完全填平缺损区，呈白色；术后8周修复组织中心部分颜色接近正常软骨组织，仅见边缘有小部分组织颜色略深，表面光滑，部分边界已融合；术后12周时修复组织外观与正常软骨组织相似，与周围正常软骨不容易辨别；术后24周修复组织同12周时相似。 对照组术后4周缺损处有白色纤维组织不完全填充，创面边缘仍呈红色；术后8周缺损处由白色纤维样组织填充，但表面十分粗糙，与周边正常组织界线清晰；术后12周缺损处修复组织呈白色，可见表面有裂隙；术后24周缺损处白色修复组织表面粗糙，与正常组织的界线仍清楚。 6.胶原复合梯度磷酸三钙支架材料修复兔关节软骨的组织学观察 1)HE及甲苯胺蓝染色 实验组术后4周，修复区见较多幼稚软骨细胞，表层细胞体积较小，数量稍多，呈水平状排列，深层细胞体积较大，排列不规则，修复面尚平整，与周围组织分界清楚，支架材料基本降解吸收；术后6周及8周，修复组织中可见明显增多的软骨细胞，与软骨下骨结合欠密切，软骨陷窝多见，细胞分布不均；术后12周修复组织和周围软骨整合紧密、厚度相近，其形态、排列、基质染色与正常软骨相似，可见“潮线”形成，浅层软骨细胞胞体较小，与关节面平行，深层细胞排列呈柱状，与关节面垂直，软骨下骨板基本修复；术后24周再生软骨组织同12周无明显变化。整个观察期，实验组修复区组织内未见淋巴细胞浸润和血管侵入。 对照组术后4周，缺损区为纤维组织覆盖，表面明显凹陷，可见血管侵入；6～24周，缺损区仍由纤维组织覆盖，修复组织与邻近组织分界清楚，表面凹陷，修复组织染色弱而不均匀，可见血管侵入。术后4、6、8、12、24周实验组组织学评分分别为7.60±0.98、5.69±0.58、4.46±0.85、4.35±0.12、4.41±0.58；对照组分别为10.25±1.05、9.04±0.96、8.96±0.88、8.88±0.68、8.66±0.54，两组比较差异有统计学意义。 2)II型胶原免疫组织化学染色 整个观察期内实验组新生组织基质内及软骨细胞胞浆内均有II型胶原阳性表达，术后12周及24周的表达强于术后4～8周，同正常软骨接近；对照组为阴性。 计算平均像素强度行II型胶原半定量分析,同一时间点实验组与对照组比较差异有统计学意义。 3)透射电镜观察 实验组4周，可见幼稚软骨细胞，细胞呈同源性集聚；12周，细胞形态具备透明软骨细胞特征，胞质内可见多数扩张的粗面内质网和小而圆的线粒体；24周，透明软骨细胞增多，形态更加成熟，细胞表面有短嵴状突起，粗面内质网丰，网池略扩张，并可见糖原颗粒，细胞周围有明显的胶原纤维并形成陷窝。 对照组4周，可见粗大纤维组织，散在纤维细胞；12周，仍为纤维组织特征；24周，全部为粗大的胶原纤维，细胞罕见。 结论： 1.双向三维可降解生物活性材料具有良好的孔隙结构。 2.双向三维可降解生物活性材料与软骨细胞有良好的相容性。 3.双向三维可降解生物活性材料可成为软骨组织工程较为理想的细胞支架材料。 4.双向三维可降解生物活性材料在动物体内可诱导关节软骨缺损后的软骨下骨与软骨的双向修复。