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研究背景与目的:前交叉韧带(Anterior cruciate ligament,ACL)损伤是膝关节最常见的一种韧带损伤,每年导致全球范围内大约400,000人进行ACL重建手术;因ACL不能自行愈合,临床上通常选用自体或异体移植物进行外科重建,以期恢复正常的膝关节运动学及防止退行性骨关节炎(Osteoarthritis,OA)发生。ACL通过被称为“腱止点”的过渡结构附着于骨组织上;腱止点典型的四层结构,是由肌腱、纤维软骨、钙化的纤维软骨和骨四层区域组成,成熟的纤维软骨界面在分散应力集中过程中起着重要的作用。因此,ACL重建的关键是怎样有效的再生正常的纤维软骨腱止点结构。通过谱系示踪的研究表明,位于软骨和肌腱/韧带之间的连接结构起源于Scx/Sox9表达阳性的一群祖细胞。Sox9是HMG盒区内的一个转录因子,在调节软骨形成过程中起着重要作用。与此同时,另一项研究表明,Sox9能诱导肌腱细胞直接转换为软骨细胞。以上研究表明,成软骨诱导因子可能在促进腱-骨界面愈合过程中起着重要作用;数项研究(如利用BMP-2,TGF-β3,PTH等)也证明,成软骨诱导因子在一定程度上具有改善腱-骨愈合的功能。软骨在腱止点发育过程中起着如此重要的作用,本文主要的目的是从形态学上观察软骨在腱止点发育过程中起到的作用,然后建立一个ACL重建的小动物腱-骨愈合模型,利用这个模型研究具有成软骨分化作用的小分子kartogenin(KGN)潜在的促进腱止点愈合能力。KGN是一种小分子杂环化合物,有研究证明其具有很强的促进内源性干细胞/祖细胞如间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)分化为软骨细胞功能。本实验旨在建立SD大鼠前交叉韧带重建模型,利用建立的小动物模型,研究具有促软骨分化能力的小分子杂环化合物KGN复合海藻酸盐凝胶对腱-骨愈合的作用。方法:1、选用6个时间点的SD大鼠,观察冈上肌腱止点的形态学特点。利用大鼠冈上肌腱止点模型,观察腱止点附着结构发育形成过程;观察不同年龄段大鼠腱止点发育过程中细胞外基质和结构变化特点。3、7、4、21、28和56天龄大鼠各3只用于冈上肌腱止点取材;标本作5μm厚的石蜡切片,然后利用番红O和HE染色观察腱止点发育。2、建立ACL重建的腱-骨愈合小动物模型。6只健康雄性SD大鼠(骨骼成熟,体重340-360g;年龄小于3月)利用自体趾长屈肌腱(flexor digitorum longus,FDL)移植物进行单侧ACL重建。1只动物术后当天取材,进行显微断层扫描(micro-computed tomography,Micro-CT);剩余动物术后第4周取材,行Micro-CT扫描、生物力学检测、组织形态学分析。3、KGN复合海藻酸盐凝胶促进大鼠腱-骨界面愈合的研究。15只雄性SD大鼠分为两组:右膝为添加含KGN海藻酸盐凝胶实验组,左膝为海藻酸盐空白组。双侧膝关节均接受自体FDL移植物重建ACL手术,分别于第2、4、8周麻醉后处死5只取材,行Micro-CT扫描和组织形态学分析观察骨隧道变化和腱-骨界面纤维软骨形成情况。结果:1.SD大鼠冈上肌腱止点在3、7天龄时,可见大量软骨细胞聚集,无典型的腱止点四层结构;腱-骨界面直到出生21天以后,才出现典型成熟的纤维软骨止点;腱止点分层矿化界面的发育与腱止点附近的软骨内骨成骨密切相关。2.本实验成功的构建了ACL重建的小动物研究模型;所有的大鼠对手术耐受良好,几乎没有出现并发症;从FDL取材到伤口缝合的平均手术时间为35分钟,最多不超过45分钟。3.Micro-CT扫描和组织形态学分析表明,注射于腱-骨界面的KGN复合海藻酸盐凝胶促进了软骨样组织的形成;此外,在8周时腱-骨界面有一定量的骨形成。结论:KGN能促进腱-骨界面软骨样的组织形成;新形成的软骨具有促进腱-骨界面新骨形成和缩小骨髓道的作用。