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[目的]通过构建TLR4基因沉默SiRNA慢病毒载体,并转染小鼠肝癌H22细胞,传代培养H22细胞,构建小鼠肝癌原位种植瘤模型,观察小鼠肝脏种植瘤体积,应用western blotting和免疫组化检测TLR4蛋白分子,MyD88蛋白分子,NF-κB蛋白分子,TRAM蛋白分子的表达情况,评价RNAi沉默TLR4信号通路的慢病毒转染H22肝癌细胞对小鼠肝脏原位种植瘤和通路关键分子表达的影响,进而研究抑制TLR4信号通路对小鼠肝脏原位种植瘤的影响。[方法](一):H22细胞的培养与传代:(1)体外传代培养:课题前期已完成构建TLR4基因沉默SiRNA慢病毒载体及转染小鼠肝癌H22细胞。取出冻存在液氮罐中的肝癌H22细胞,在水浴锅中快速解冻,加入DMEM培养基,离心弃上清液,转移到培养瓶,放入恒温培养箱中进行培养。观察细胞的生长,隔天进行换液。传代培养H22肿瘤细胞数远大于1×107。(2)体内传代培养:离心收集处于对数期的H22肿瘤细胞,用生理盐水洗涤后,接种于小鼠体内,腹水大量形成后,提取H22肝癌细胞重复操作,如此腹水传代3次后,收集小鼠H22肝癌细胞,用生理盐水洗涤后备用。(二)构建小鼠肝癌原位种植瘤模型:在无菌环境中,开腹直视下,用50μL微量注射器向小鼠肝癌注入一定数量的肿瘤细胞,用烧红的铁丝封闭针眼,将肝脏回纳至小鼠腹腔,缝合腹壁。(三)Western-blot检测:提取小鼠肝脏种植瘤组织,选取RNAi组、空载体转染组及对照组,分别提取蛋白,经电泳分离,显影,灰度值计算等步骤,检测TLR4、MyD88、NF-κB、TRAM蛋白分子的表达并比较各组差异。(四)免疫组化检测:制作小鼠肝脏肿瘤组织的石蜡切片,通过脱水-抗体修复-免疫反应-化学染色-脱水封片等步骤,在显微镜下观察实验结果,并于相同条件下拍摄照片进行结果分析,采用HSCORE积分法半定量分析。[结果](一)通过H22肝癌细胞的传代培养,收集了大量适应在小鼠肝脏中生长的肿瘤细胞。(二)肿瘤模型中所有小鼠肝脏均成功构建了小鼠肝癌原位移植瘤模型,HE病理切片证实为肿瘤组织。(三)经Western-blot检测提示各蛋白各组表达量具有差异,差异有统计学意义,且RNAi组表达最少。(四)经免疫组化检测提示各蛋白各组表达具有统计学差异,且TLR4信号通路抑制组各蛋白表达减少。[结论](一)成功复苏了各组H22肝癌细胞,并进行了在小鼠体外和体内传代培养。(二)成功构建了各组小鼠肝癌原位移植瘤模型。(三)实验证实了 RNAi慢病毒载体干扰TLR4信号抑制小鼠肝脏原位种植瘤生长机制与抑制TLR4信号通路关键蛋白分子TLR4、MyD88、NF-κB、TRAM表达有关。