锌（Zn）和铁（Fe）是维持植物生长发育必不可少的微量元素,当Zn或Fe缺乏或过量时,均会影响植物生长,甚至导致植物死亡,所以维持Zn稳态和Fe稳态对于植物的正常生长至关重要。目前在植物中已发现多个基因家族参与Zn转运、Fe转运或Zn/Fe转运,共同维持Zn稳态和Fe稳态。本文通过对本课题组先前发现的拟南芥（Arabidopsis thaliana）Zn转运蛋白At ZNE1（ZINC NUTRITION ESSENTIAL 1）生理功能和锌稳态调控分子机理进行深入研究。同时发现At ZNE1同源蛋白广泛存在重要农作物中,结构保守。因此对At ZNE1基因功能的深入研究为以后分子育种提高作物锌含量提供一定的理论依据。羊草（Leymus chinensis）作为优质牧草是内蒙古草原的建群物种,但对其锌铁矿质营养调控机理研究仍是空白,通过对羊草转录组测序,挖掘羊草锌铁转运蛋白编码基因,研究其转运特征,为日后羊草矿质营养改良提供理论基础。实验结果如下:（1）At ZNE1参与拟南芥锌铁依赖性生长,但不参与拟南芥对锌铁的积累。在高锌(75μM Zn²⁺)或低铁(0μM Fe²⁺)培养基中,拟南芥幼苗At ZNE1缺失突变体（atzne1）与野生型Col-0相比生长受到抑制,叶片发黄死亡。而遗传互补材料atzne1-1/At ZNE1-GFP,在高锌或低铁培养基中恢复正常生长与野生型Col-0表型相同。在高锌或低铁水培条件下,拟南芥突变体atzne1成苗叶片同样变黄甚至死亡。测定野生型Col-0与突变体atzne1,在高锌或低铁水培条件下莲座叶和根锌铁含量,发现无显著差异。将野生型Col-0和突变体atzne1在全营养水培液中培养直至种子成熟,测定种子锌铁含量,发现Col-0与atzne1无显著差异。（2）At ZNE1具有Zn²⁺转运功能。At ZNE1不属于拟南芥ZIP家族成员,预测可转录形成两个转录本At ZNE1.1和At ZNE1.2,其中At ZNE1.2在5’端较At ZNE1.1多一个外显子可编码24个氨基酸,但只克隆得到At ZNE1.1用于所有实验（用At ZNE1表示）。互补酵母锌铁转运缺陷型突变体,发现At ZNE1能够恢复高锌敏感酵母突变体△zrc1/△cot1（液泡膜锌转运蛋白缺失突变体）在高锌培养基中的生长表型,不能恢复低锌敏感酵母突变体△zrt1/△zrt2（细胞膜锌转运蛋白缺失突变体）在低锌培养基中的生长表型,以及低铁敏感酵母突变体△fet3/△fet4（细胞膜铁转运蛋白缺失突变体）在低铁培养基中的生长表型。表明At ZNE1能够介导Zn²⁺由低浓度向高浓度的转运,但不能介导Zn²⁺或Fe²⁺由高浓度向低浓度的转运。（3）At ZNE1中位于细胞质非跨膜结构域CytoⅠ与非细胞质非跨膜结构域Non-CytoⅠ和Non-CytoⅡ可与Zn²⁺结合,其中Non-CytoⅡ中的组氨酸是Zn²⁺结合位点同时也是Zn²⁺转运所必需的,所有非跨膜结构域均不能与Fe²⁺结合。预测At ZNE1含有14个跨膜结构域,人工合成At ZNE1的非跨膜结构域。通过等温滴定发现,位于细胞质非跨膜结构域CytoⅠ与非细胞质非跨膜结构域Non-CytoⅠ和Non-CytoⅡ能够与Zn²⁺结合。Non-CytoⅡ中的组氨酸突变为丙氨酸后导致失去Zn²⁺结合功能,同时将At ZNE1对应于Non-CytoⅡ中的组氨酸突变为丙氨酸（At ZNE1?H131A）,互补高锌敏感酵母突变体△zrc1/△cot1,不能恢复△zrc1/△cot1在高锌培养基中的生长表型,表明Non-CytoⅡ中的组氨酸是Zn²⁺转运所必需的。所有非跨膜结构域与Fe²⁺反应无热量变化,表明不能与Fe²⁺结合。（4）At ZNE1与高尔基体标记蛋白及囊泡运输标记蛋白共定位,缺失后不影响拟南芥细胞内高尔基体Zn²⁺的积累。At ZNE1-GFP在拟南芥叶肉细胞原生质体瞬时表达定位于高尔基体,同时在烟草表皮细胞中瞬时表达,发现与囊泡运输相关标记蛋白At VTI13-RFP、At CLC2-RFP及At ST1-RFP共定位。分别提取野生型Col-0与突变体atzne1叶肉细胞原生质体,利用300μM Zn²⁺处理液进行处理,结合膜透过性锌离子染料Zinpyr-1进行染色,发现高尔基体中Zn²⁺含量相互间无显著差异。（5）At ZNE1在50种植物中存在同源基因,小麦、狗尾草和二穗短柄草ZNE1同源蛋白具有Zn²⁺转运功能。利用At ZNE1氨基酸序列进行同源性分析发现,At ZNE1同源基因广泛存在于植物中。将小麦、狗尾草、二穗短柄草ZNE1同源基因分别转化酵母锌铁转运缺陷型突变体,均能够恢复高锌敏感酵母突变体△zrc1/△cot1在高锌培养基中的生长表型,不能恢复低锌敏感酵母突变体△zrt1/△zrt2在低锌培养基中的生长表型,以及低铁敏感酵母突变体△fet3/△fet4在低铁培养基中的生长表型。即均能够介导Zn²⁺由低浓度向高浓度的转运,但不能介导Zn²⁺或Fe²⁺由高浓度向低浓度的转运,与At ZNE1功能相同。表明ZNE1在进化过程中功能保守。（6）鉴定羊草Zn转运蛋白3个,Fe转运蛋白2个。对羊草转录组数据进行生物信息学分析,筛选锌铁转运蛋白编码基因进行功能鉴定。发现Zn转运蛋白中Lc234720预测为At HMA4同源基因,定位于液泡膜,能够恢复高锌敏感酵母突变体△zrc1/△cot1在高锌培养基中的生长表型,介导Zn²⁺由低浓度向高浓度转运。Lc228182预测为At HMA2同源基因,定位于高尔基体,能够恢复高锌敏感酵母突变体△zrc1/△cot1在高锌培养基中的生长表型,介导Zn²⁺由低浓度向高浓度转运。Lc240210预测为At ZNE1同源基因,定位于内质网,能够恢复高锌敏感酵母突变体△zrc1/△cot1在高锌培养基中的生长表型,介导Zn²⁺由低浓度向高浓度转运,其非跨膜结构域中位于细胞质的CytoⅠ、Ⅱ、Ⅴ、Ⅷ和非细胞质的Non-CytoⅠ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ能够与Zn²⁺结合。Fe转运蛋白中Lc235481预测为At ZIP10同源基因,定位于液泡膜,能够恢复低铁敏感酵母突变体△fet3/△fet4在低铁培养基中的生长表型,介导Fe²⁺由高浓度向低浓度转运。Lc206852预测为At ZIP1同源基因,定位于内质网,能够恢复低铁敏感酵母突变体△fet3/△fet4在低铁培养基中的生长表型,介导Fe²⁺由高浓度向低浓度转运,其非跨膜结构域中位于细胞质的CytoⅠ、Ⅱ能够与Fe²⁺结合,但所有非跨膜结构域不能与Fe³⁺结合。（7）羊草Zn或Fe转运蛋白编码基因转录水平受环境中锌铁浓度变化诱导。在高锌(150μM Zn²⁺)或低铁(0μM Fe²⁺)水培液中,羊草成苗根中Lc ZNE1,Lc HMA4,Lc ZIP1转录水平发生上调。在高铁(500μM Fe²⁺)水培液中,羊草成苗根中Lc HMA4和Lc ZIP1转录水平发生上调以及根叶中Lc ZIP10转录水平发生上调。相反在低锌(0μM Zn²⁺)水培液中,羊草成苗根中Lc HMA2转录水平发生下调。本文研究发现新型Zn转运蛋白At ZNE1参与介导拟南芥细胞高尔基体Zn²⁺转运,同时可能参与调控细胞内囊泡运输以维持细胞内Zn²⁺稳态。At ZNE1缺失后导致拟南芥对高锌或低铁环境适应性减弱,但不影响拟南芥叶、根和种子中Zn和Fe含量以及高尔基体对Zn的积累。At ZNE1的发现是对植物调控Zn稳态机理重要补充。在羊草中已挖掘并验证3个Zn转运蛋白和2个Fe转运蛋白,这些转运蛋白的发现为日后羊草矿质营养生物强化提供理论基础。