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生物活性物质S-腺苷甲硫氨酸(SAM)广泛存在于生物体内,参与体内核酸、蛋白质和磷脂的合成与代谢,可以改善细胞代谢,对于维护细胞正常代谢必不可少。目前SAM发酵生产菌株主要为酵母菌,酵母的发酵周期较长,通常超过100 h,且发酵过程中要不断添加前体物质L-甲硫氨酸,同时酵母细胞膜壁较复杂,给后期提取及纯化带来困难。为克服这些缺陷,本研究探索了了利用谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)合成SAM的新方法。C.glutamicum可以积累SAM合成的前体物质L-甲硫氨酸,且其基因组已经被测序,因而通过代谢工程系统改造C.glutamicum生产SAM具有理论价值和应用前景。本论文针对C.glutamicum野生型菌株ATCC 13032和异亮氨酸高产菌IWJ001进行了一系列代谢工程改造,提高了其SAM合成水平。主要结论如下:(1)将来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、C.glutamicum、大肠杆菌(Escherichia coli)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的SAM合成酶基因在E.coli JM109进行诱导表达,发现C.glutamicum来源的metK和S.cerevisiae来源的基因SAM2编码的SAM合成酶活性比较高。将基因metK和SAM2分别克隆到E.coli-C.glutamicum穿梭载体pDXW-8中,并转化C.glutamicum ATCC 13032。研究发现ATCC 13032/pDXW-8-metK中SAM合成酶MetK过量表达,酶活为7.9 U·g-1,SAM产量为97 mg·L-1,是对照菌ATCC 13032/pDXW-8的5.27倍。而ATCC 13032/pDXW-8-SAM2不能表达SAM2编码的SAM2,与对照相比无酶活及SAM产量的提高。(2)首先针对ATCC 13032/pDXW-8-SAM2菌株,RT-PCR和SDS-PAGE分析发现SAM2基因可转录但不能翻译。为了在C.glutamicum正常表达,通过密码子优化将SAM2序列优化为SAM2C,并转化至C.glutamicum ATCC 13032。结果显示ATCC 13032/pDXW-8-SAM2C可以过量表达SAM合成酶,酶活为2.2 U·g-1,SAM产量达105 mg·L-1。然后进行了分批发酵,结果显示ATCC 13032/pDXW-8-metK在分批补料发酵36 h后,SAM产量达316 mg·L-1;而ATCC 13032/pDXW-8-SAM2C在发酵60 h后,SAM积累达239 mg·L-1。将上述菌株的SAM合成酶MetK和SAM2C分别进行分离纯化及酶学性质研究。结果显示MetK和SAM2C最适反应温度均为35 oC,最适反应pH均为8.5,对甲硫氨酸的Km值分别为0.51和1.04 mM,对ATP的Km值分别为2.07和1.99 mM。动力学研究表明MetK和SAM2C对ATP的亲和力相差不大,但前者对甲硫氨酸的亲和力比较高。(3)通过代谢工程构建了一系列SAM高产菌株。首先以C.glutamicum ATCC 13032的突变菌WTQ102出发菌,通过进一步基因敲除构建了菌株WHQ103。WHQ103缺失了编码McbR调控蛋白的基因mcbR、编码高丝氨酸激酶的基因thrB和编码胱硫醚-γ-合酶基因met B,SAM产量为74.3 mg·L-1。然后在WHQ103基础上进一步敲除编码硫同化代谢调控酶的基因Ncgl2640,构建了菌株WHQ104,使SAM产量提高到95.4 mg·L-1。最后在WHQ104中过量表达metK基因和编码透明颤血红蛋白的基因vgb,构建了菌株WHQ104/pJYW-4-metK-vgb;进一步表达甲硫氨酸合成途径上的关键基因metX、metY、抗反馈抑制的homm和lysCm基因,构建了菌株WHQ104/pJYW-4-metK-vgb-metYX-homm-lysCm。发酵结果显示WHQ104/pJYW-4-metK-vgb在36 h可产181.8 mg·L-1 SAM,而WHQ104/pJYW-4-metK-vgbmetYX-homm-lysCm在60 h可产SAM 180.6 mg·L-1。同时发现针对WHQ104/pJYW-4-metK-vgb,添加甲硫氨酸不能进一步提高SAM产量,表明甲硫氨酸供给已非SAM合成的限制性因素,胞内ATP水平可能为限制SAM合成水平的重要因素。(4)通过代谢工程改造构建L-异亮氨酸和SAM联产菌株。在C.glutamicum异亮氨酸高产菌IWJ001中过量表达metK和vgb基因,可实现胞外分泌L-异亮氨酸,及胞内积累SAM。与IWJ001/pDXW-8相比,IWJ001/pDXW-8-metK胞内SAM产量提高了11.65倍,IWJ001/pDXW-8-metK-vgb胞内SAM产量提高了14.95倍。进一步表达丙酮酸激酶、苹果酸:醌氧化酶、苹果酸脱氢酶的编码基因pyk、mqo、mdh,构建菌株IWJ001/pDXW-8-metK-vgb-pyk、IWJ001/pDXW-8-metK-vgb-mqo和IWJ001/pDXW-8-metK-vgb-mdh,但这些菌株SAM产量不及IWJ001/pDXW-8-metK-vgb。IWJ001/pDXW-8-metK-vgb在摇瓶发酵72 h可产0.55 g·L-1 SAM和4.24 g·L-1 L-异亮氨酸,分批发酵72 h,可产0.67 g·L-1 SAM和13.88 g·L-1 L-异亮氨酸。