人胚胎间充质干细胞向平滑肌细胞分化体外模型的建立及分化机制初探

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研究背景和目的:动脉粥样硬化及其并发症(心肌梗塞和中风)是发达及发展中国家人们的主要死因。其中血管平滑肌细胞(SMC)分化状态的改变是引发阻塞性动脉粥样硬化病的关键因素之一。然而,长期以来人们对SMC分化的调节机制却所知甚少。研究遇到的一个主要技术难题就是缺乏有效的体外分化体系。尽管近年来人们建立了一些体外诱导动物多能细胞分化成SMC的培养系统,然而由于种属间差异,来自动物细胞的研究结果不能直接应用于临床医学。因此建立一个人SMC体外分化模型自然是这一领域的发展所需。在胚胎血管发育过程中,首先形成血管内皮细胞(EC)管,随后血管壁细胞(SMC或周细胞)才在EC管周围出现,这提示血管EC可能有招募血管壁细胞的前体细胞,并诱导其向SMC分化的作用。这一作用在动物细胞实验中已得到证实。本研究模拟血管发生过程中SMC分化过程,建立人脐静脉内皮细胞(HUVEC)诱导人胚胎间充质干细胞(HEMSC)向SMC分化的体外模型;并应用该模型,初步探讨人血管SMC的分化机制,主要侧重于血管EC和血管壁细胞前体细胞间相互接触,包括形成缝隙连接和其间的黏附分子(如integrins),在血管SMC分化过程中的作用及机制的研究。HUVEC是一个重要的体外实验人体细胞,广泛应用于生物医学多个领域,但HUVEC有体外增殖困难,容易老化的缺点,常需在其培养液中添加昂贵的生长因子维持其生长。在前面的研究中我们也遇到了这一问题。因此我们构建人血管内皮生长因子(hVEGF)-121的真核细胞表达质粒,将hVEGF121基因转染进HUVEC,通过旁分泌作用来加快其生长速度。第二军医大学博士学位论文中文摘要胞可能经膜上的孔(基膜上的窗孔)形成类似活体血管肌内皮连接 (myoendothelial junetions)样接触,做为接触共培养组;将HEMSC单独种在多孔膜一侧,做为对照组。在1、2、4、8d用免疫细胞化学和/或免疫荧光法检测两种细胞中上述SMC分化标志蛋白表达情况;在1、2、3、4d用R不PCR法和westem blotting法检测两种细胞中SMC分化晚期标志蛋白sM一MHC的mRNA和蛋白质表达情况。结果:(l)原代培养的HUVEC不表达SM一a一actin、ealponin和SM一MHe;传代培养至4一8代的HEMSC中有SM一a一aetin和ealponin表达,但没有检测到SMC分化的晚期标志蛋白SM一MHC。(2)接触共培养组在共培养4d用免疫细胞化学和/或免疫荧光法即可观测到HEMSC中有SM一MHC表达,几乎所有细胞中均可见到,或弱或强,沿细胞长轴方向呈丝状分布;至共培养8d表达水平进一步加强。而HEMSC单独培养组在各时间点均未检测到有SM一MHC表达。接触共培养组在各时间点HEMSC的SM一a一actin和calPonin表达水平差异不明显;HuvEc在各时间点均未检测到上述任何一种sMc标志蛋白。RT-pCR和westem blotting实验表明,接触共培养组在共培养2d即可观测到HEMSC表达SM一MHC mRNA和蛋白质,之后随共培养时间延长表达水平升高。在各时间点,接触共培养组HUVEC中和单独培养的HEMSC中均未检测到有SM一MHC mRNA和蛋白质的表达。结论:我们成功建立了HEMSC向SMC分化体外模型。该模型逼真地模拟了胚胎发育过程中血管SMC的分化过程。用cen。ulture inserts的多孔膜做为血管基膜的替代物,在其两侧种植HUVEC和HEMSC共培养,HUVEC可诱导HEMSC分化SMC样细胞,同时表达SMC的分化早、中、晚期标志蛋白。实验证明SMC的分化晚期标志蛋白SM一MHC(组成SMC“收缩装置”主要成份)是HEMSC向SMC分化研究的一个有价值的标志物。接触共培养Zd HEMSC中开始表达sM一MHcmRNA和蛋白质,之后随共培养时间延长表达水平升高;单独培养的HEMSC中一直没有检测到SM一MHC的表达。第二部分:血管平滑肌细胞分化机制初探方法:(1)检测SMC分化过程中TGF一邵的信号转导分子磷酸化SmadZ(P一SmadZ)及转录因子SRF(serumre印onsive faetor)的表达情况:设HUvEC第二军医大学博士学位论文中文摘要和HEMSC接触共培养组和HEMSC单独培养组,方法同第一部分。在6、12、24、36、48、60h用westem blotting法检测HEMSC中p一smadZ和s即、免疫细胞化学法检测HEMSC中P一SmadZ的表达情况。(2)观测血管EC与血管壁细胞前体细胞间接触对SMC分化的影响及与TGF一印作用间关系:将HUvEC和HEMSC分别种在多孔膜两侧,做为接触共培养组;将HUVEC和HEMSC分别种在六孔板底和多孔膜上,做为不接触共培养组。在共培养4d用免疫细胞化学和/或免疫荧光法及westem blotting检测HEMSC中SM一MHC的表达情况;在共培养36h用western blotting法检测HEMSC中P一SmadZ和S好、免疫细胞化学法检测P一SmadZ的表达情况。(3)观测血管EC与血管壁细胞前体细胞间gap junctions和豁附分子integrins对SMC分化的影响及与TGF一pl作用间关系:在HUVEC和HEMSC接触共培养体系中分别加入gap junctions功能抑制剂18a一glyeyrrhetinie aeid(18a一GA)、inte红ins阻断剂GLY-ARG一GLY-ASp一SER(GRGDS)多肤和无活性的SER一ASP一GIJY二ARG一GLY(SDGRG)多肤,用不加入任何物质的HUvEC和HEMSC接触共培养组做对照。检测时间、方法、指标均同(2)。结果:(l)westem blotting实验表明,接触共培养组HEMsC中p一SmadZ和SRF均有?
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