禽白血病病毒(Avian leukosis viruses,ALV)属于反转录病毒科(Retroviridae)α反转录病毒属(Alpharetrovirus)的一类病毒。ALV感染不仅诱发多种肿瘤性疾病,还可引起大多数感染鸡的亚临床症状,如产蛋下降、免疫抑制或生长迟缓。根据病毒中和试验和gp85的特性,迄今为止将ALV分为A-J十个亚群,以及新鉴定的K亚群。自20世纪90年代以来,禽白血病特别是J亚群禽白血病病毒(ALV-J)给我国的养鸡业造成了重大的经济损失,严重危害我国白羽肉鸡、蛋用型鸡、黄羽肉鸡和固有的地方品种鸡等各种类型鸡的健康发展。先天垂直感染是ALV的重要传播方式。由于宿主对ALV难以产生有效免疫应答反应,加之ALV基因组变异频率较快,至今为止,尚未有商品化的疫苗可用。由于ALV亚群的多样性,感染和传播的复杂性,给我国的养鸡业造成了重大的经济损失,本研究对我国不同鸡群进行了ALV的流行病学调查,并对公鸡精液在ALV传播中作用进行了系统的研究;通过研究不同佐剂及免疫增强剂对ALV-J gp85重组蛋白诱导抗体的产生,从而加速和辅助我国ALV的净化;对新分离到的ALV-K全基因组做了系统的分析,并研究了ALV-K的原型株JS11C1对SPF鸡的致病性;本研究利用反向遗传操作技术,构建JS11C1株的感染性克隆,并在此基础上首次构建了env(J)-LTR(K)和env(K)-LTR(J)的嵌合感染性克隆,借以探究env基因在ALV-K的致病性中所发挥的作用。1.我国不同鸡群中ALV的流行病学调查及其准种分析本研究对我国12个不同地方品系鸡群中ALV进行了分离鉴定,共分离鉴定到14株ALV,对这些分离毒株gp85基因进行了克隆测序和亚型鉴定,结果显示有2株ALV-A,1株ALV-B,8株ALV-J和3株ALV-K。其中,2012年从山东某地方品系鸡群发生疑似为血管瘤的肿瘤病例中分离到5株J亚型ALV-J,定名为SDLY1201-SDLY1205。分别扩增五株ALV-J的gp85基因,并对五个毒株准种多样性进行分析和比较。结果显示:五个毒株其gp85核苷酸长度分别为921bp、921bp、924bp、918bp、912bp,其不同克隆之间的氨基酸同源性分比为99.3%-100%、99.3%-100%、99.4%-100%、98.4%-100%、99.0%-100%,其中序列完全相同的克隆比例分别为13/20、17/20、17/20、9/18、16/19,代表了五个毒株中优势准种的比例,对五个毒珠优势准种的gp85比较显示其氨基酸同源性为89.2%-92.5%。本研究证实即使在同一时期同一鸡群感染的不同个体中,ALV-J野毒株准种也存在巨大的差异,特别是其中优势准种发生了改变。2.公鸡精液在ALV传播中的作用长期以来,对ALV感染鸡群过程中公鸡的作用特别是对后代的传播作用一直没有得到明确的阐述。本研究通过鸡胚静脉接种J亚群禽白血病病毒(ALV-J),获得持续病毒血症的公鸡,并将这些公鸡的精液人工授精给产蛋期的母鸡,1周后收集种蛋并孵化出雏鸡。结果显示,两只受精的母鸡在4-5w时产生ALV-J的抗体,在6只母鸡的泄殖腔中检测到p27抗原,母鸡产的26个鸡蛋中检测到3个蛋清P27为阳性。此外,对12只母鸡进行病毒分离时发现,在授精后6w均没有检测到病毒血症的存在。然而,1周龄时从34只后代的雏鸡中的1只雏鸡中分离到ALV-J,其与从公鸡精液样品中分离到的ALV-J的gp85基因的序列同源性为98.4%-99.2%。我们的研究表明,ALV-J可以通过公鸡的精液的人工授精感染母鸡并且垂直传播给子代的雏鸡。这一发现对于改进和完善种鸡场ALV净化程序有重要的指导作用。3.不同佐剂及免疫增强剂对ALV-J gp85重组蛋白诱导抗体产生的研究原核表达的ALV-J gp85囊膜蛋白能够诱导SPF鸡产生抗体,但抗体阳性率和抗体水平均较低,本研究观察了免疫增强剂松花粉多糖(TPPPS)联合不同佐剂(CPG、YF01)对增强ALV-J gp85囊膜蛋白免疫后抗体水平的影响。结果显示,单一gp85重组蛋白只能诱导少数鸡产生抗体,且产生的抗体效价较低、维持时间较短;而YF01或Cp G佐剂分别联合重组蛋白能够使大部分免疫鸡产生抗体,且效价较高,当两种佐剂再联合使用免疫增强剂泰山松花粉多糖后能够使产生的高效价抗体维持时间更长。对ALV-J抗体水平较高的4组收集种蛋进行孵化检测母源抗体,人工攻毒后观察母源抗体对雏鸡的保护效果。结果发现发现添加免疫增强剂TPPPS组产生的母源抗体水平较没有添加组高,且对雏鸡具有较高的保护效力,与对母体的使用效果一致。通过本研究我们可以发现泰山松花粉多糖联合使用YF01和CPG佐剂可以增强gp85重组蛋白的免疫原性,产生较好的免疫保护作用,这将为开发更加有效的ALV-J亚单位疫苗提供有力实验依据,高效亚单位疫苗的研制也将为J亚群禽白血病的净化提供更大的帮助。4.K亚群ALV的全基因组分析及其致病性研究本研究从我国地方品系鸡群中分离鉴定到了3株ALV-K,并对其做了全基因组分析,结果表明,这3株ALV-K与之前已发表的ALV-K毒株位于一个单独的分支,与鸡群中其他已知亚群的ALV均不在同一分支中。其中,与SDAUAK-11、SDAUAK-12和SDAUAK-13的全基因序列同源性最高的分别为中国广东分离株GD14LZ,GDFX0601,江苏分离株JS11C1,与其它ALV-K毒株的同源性分别为90.8%-97.7%,90.8%-97.7%,91.2%-97.3%。为研究ALV-K的致病性,将2011年分离自中国某地方品系鸡的ALV-K原型株JS11C1株分别采用卵黄囊接种、鸡胚静脉接种和1日龄腹腔接种三种方式感染SPF鸡,系统记录分析了感染鸡群的病毒血症和抗体产生动态、对感染鸡群体重增重的抑制以及感染鸡群对疫苗免疫应答的影响等方面,以对JS11C1的致病性进行全面评估。结果表明,当通过卵黄囊接种和鸡胚静脉接种时,JS11C1可以诱发感染鸡的持续病毒血症,抑制感染鸡群的体重增重和对疫苗的免疫应答,并可诱发一定比例的淋巴细胞肿瘤。相对于其他亚群ALV,JS11C1的传播效率和致病性相对较弱。本研究系统研究了JS11C1株对SPF鸡的致病性,为下一步研究其致病机制和科学防控奠定了基础。5.env基因在ALV-K致病作用中的研究在所有亚群ALV中,ALV-J致病性最强,而ALV-K与ALV-A、B等类似。为了阐明env基因和LTR片段在ALV-J与ALV-K致病性差异的作用,本研究构建和比较了ALV-J野毒株SDAU1005和ALV-K野毒株JS11C1及其重组嵌合病毒renv(J)-LTR(K)和renv(K)-LTR(J)的感染性克隆的生物学特性。在这4个感染性克隆病毒中,r SDAU1005(ALV-J)在DF-1细胞上的复制能力最强,r JS11C1最弱,而2个重组病毒介于二者之间,其强度次序r SDAU1005>renv(K)-LTR(J)>renv(J)-LTR(K)>r JS11C1。此外,在与致病性相关的对增重、对法氏囊和胸腺发育及疫苗免疫后抗体反应的抑制作用上,这一比较结果表明,env基因和LTR片段在影响ALV-J与ALV-K之间致病性差异中起着重要作用,其中env基因的作用似乎大于LTR片段。本研究发现ALV-K在细胞上的复制水平显著低于ALV-J及其他亚群,这也为改进净化程序中的检测方法和判定标准提供了新的科学数据。