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Ribosomal L1-domain-containingprotein 1(RSL1D1),又名细胞衰老抑制基因蛋白,属于核糖体L1p/L10e家族。RSL1D1最早是在研究细胞衰老的过程中发现并克隆的,最近研究表明,RSL1D1通过调控p53-MDM2信号通路在肿瘤细胞增殖与凋亡等方面发挥重要作用,是肿瘤研究中一个至关重要的新靶点。恶性肿瘤是一类严重威胁到人们生命健康的疾病。目前,工程抗体逐渐成为肿瘤治疗最重要的手段之一。作为小分子抗体的代表,单链抗体以其免疫原性弱、分子量小、体内滞留时间短等优点成为抗体工程研究领域的热点。本研究旨在阐明RSL1D1与p53相互作用的机理并构建RSL1D1的单链抗体,为以RSL1D1为靶点的肿瘤治疗提供理论依据和材料基础。首先,我们通过体外GST pulldown技术鉴定了 RSL1D1与p53的互作结构域。根据相关文献及我们近期研究结果,RSL1D1可通过与p53直接结合而调控p53的功能。为了进一步揭示其作用机理,根据RSL1D1与p53蛋白的分子结构,我们构建了一系列RSL1D1与p53的截短突变体。利用原核表达及亲和层析获得纯化的蛋白,通过GST pulldown实验确定RSL1D1的N端和C端均能与p53的中央DNA结合结构域直接结合。接着,我们制备了 RSL1D1单克隆抗体。以纯化的融合蛋白His-TrxA-RSL1D1-NT和His-TrxA-RSL1D1-CT共同免疫小鼠。经细胞融合、筛选与克隆化,最终获得了 27株稳定分泌抗体的杂交瘤细胞。将其中3株(1E5-1E10、1C9-2C8、1D8-2B10)注入小鼠腹腔诱生腹水,Protein A亲和层析纯化抗体。通过SDS-PAGE、免疫印迹法和间接ELISA法分别比较了三个抗体的亚型、纯度、分子量、效价、灵敏度、亲和常数和特异性;其中1E5-1E10的亚型为IgG1,抗体纯度在95%以上,效价为1:10000,检测限为0.1 ng,亲和常数为(4.88±0.48)× 108 L/mol,检测内源性RSL1D1蛋白时为特异性单一条带,是一个灵敏度高、亲和力高、特异性强的抗体。最后,我们构建和鉴定了 RSL1D1单链抗体。从1E5-1E10杂交瘤细胞中提取总RNA,反转录获得cDNA,PCR扩增编码抗体重链和轻链可变区的基因,再通过连接肽编码序列连接两个片段,从而构建pET-32a-SUMO-ScFv,并通过大肠杆菌BL21(DE3)诱导表达和镍琼脂糖凝胶层析柱纯化,获得His-SUMO-ScFv。利用GST pulldown实验和双分子荧光互补技术验证ScFv与RSL1D1的结合情况。结果表明,我们所获得的单链抗体可以和RSL1D1的N端结构域直接结合。综上所述,本研究证明了 RSL1D1可直接与p53结合,且其N端和C端两个结构域均是和p53的中央DNA结合结构域(第102-292位氨基酸)直接结合。我们推测RSL1D1是通过直接与p53结合的方式来抑制p53的活性,这为以RSL1D1为靶点的肿瘤治疗提供了重要线索。并且本研究已经成功构建了 RSL1D1单链抗体,为后续的论证和研究提供了材料基础。