论文部分内容阅读
年龄相关性白内障(age-related cataract, ARC)是世界首位致盲性眼病,其防治工作已成为本世纪防盲治盲工作的重点。研究ARC的发病机制,通过预防白内障发生或延缓其发展的途径征服白内障,己成为一项全球性的社会和经济问题。目前已公认氧化损伤是ARC发生的主要危险因素和始动环节。这一过程的病理学基础,主要表现在晶状体上皮细胞(lens epithelial cells, LECs)的凋亡和晶状体蛋白改变两方面。其中,LECs的凋亡又是晶状体蛋白改变的发生因素之一。因此,ARC的发生发展与LECs的状态变化密切相关。Li等于1995年首次提出,LECs的凋亡是各型非先天性白内障共同的细胞学基础。基于以上背景,LECs的凋亡相关研究成为ARC发病机理研究中的热点问题,寻找避免LECs凋亡的保护途径、或激活机体自身的抗凋亡保护体系,无疑具有重要的干预意义。沉默信息调节因子相关酶1(sirtuin type 1, SIRT1)即为机体自身抗衰老、抗凋亡体系的重要一员。SIRT1是一种细胞代谢辅酶NAD+依赖的111类组蛋白去乙酰化酶,具有延长低等生物寿命和延缓多种年龄相关性疾病发展的作用。它主要通过组蛋白脱乙酰基作用调节P53和又头转录因子(Forkhead box O, FOXOs)等转录因子的活性,在抵抗氧化应激、对抗细胞凋亡等活动中发挥重要作用。SIRT1已成为治疗年龄相关性疾病的颇具潜力的药物靶点。遗憾的是,在眼科最常见的年龄相关性疾病ARC相关研究中,尚未对SIRT1有任何涉猎。因此,本研究将观察人LECs (human LECs, HLECs)中SIRT1基因的表达,及其在ARC的发生及氧化损伤环境中的表达变化和对HLECs的保护作用,并进一步研究SIRT1通过其下游P53通路对HLECs的保护机制。第一部分人年龄相关性白内障发生中SIRT1基因及其下游通路蛋白的表达变化目的观察HLECs中SIRT1基因及其下游P53及FOXOs通路蛋白表达在ARC发生中的表达改变,初步分析SIRT1在ARC发生中的保护作用和可能的作用途径。方法眼库取材晶状体前囊膜分为:(1)青年组:正常青年人晶状体前囊膜(20-40岁);(2)老年组:正常老年人晶状体前囊膜(50-70岁);(3)ARC组:ARC老年人晶状体前囊膜(50-70岁且伴有ARC),各82例。各组样本行SIRT1 mRNA复合逆转录聚合酶链反应(real-time quantitative reverse transcription, RT-PCR)检测,SIRT1、p53、乙酰化p53、FOXO3a、FOXO4、p27、p130、Bim蛋白的蛋白免疫印迹(western blot, WB)检测,SIRT1免疫荧光染色、原位末端转移酶标记技术(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling, TUNEL)染色。结果SIRT1 mRNA转录水平RT-PCR检测2(△△Ct)值为青年组(1.000±0.143),老年组(0.451±0.065),ARC组(0.715±0.171),差异有统计学意义。SIRT1蛋白WB检测及免疫荧光染色均为青年组最强,ARC组居中,老年组最弱。P53通路检测显示,P53蛋白表达为青年组最低,老年组次之,ARC组最高,但具有凋亡相关活性的乙酰化p53为ARC组低于老年组。FOXOs通路检测显示,FOXO3a、FOXO4、p27kip1、p130蛋白表达均为ARC组最高,凋亡相关Bim蛋白表达为ARC组最低,差异有统计学意义。TUNEL检测发现,各组HLECs的凋亡百分比分别为:青年组(0.8±0.7)%,老年组(8.5±2.7)%,ARC组(25.0±9.8)%,差异有统计学意义。结论SIRT1基因在人晶状体上皮细胞中的表达随年龄增长而减少,但在ARC发生中呈保护性上调。下游通路蛋白检测提示,上调的SIRT1可能通过p53通路与FOXOs通路诱导细胞周期停滞、抑制细胞凋亡,在ARC发生中发挥保护作用。第二部分增强与抑制SIRT1蛋白功能对氧化环境下HLECs凋亡的影响目的观察SIRT1活性改变对氧化环境下培养的HLECs凋亡的影响,分析SIRT1对HLECs的保护作用。方法体外培养HLECs系SRA01/04,分为4个大组:(1)正常对照组:常规培养;(2)H2O2组:加入H2O2终浓度为400μmol/L; (3) SIRT1激活剂白藜芦醇(resveratrol, RES)组,分设4个RES浓度组:加入H2O2及RES溶液,H2O2终浓度为400μmol/L, RES终浓度分别为5,10,20,40μmol/L; (4) SIRT1抑制剂烟酰胺(Nicotinamide, NAM)组,分设4个NAM浓度组:加入H2O2及NAM溶液,H2O2终浓度为400μmol/L, NAM终浓度分别为25,50,100,200μmol/L。各组进行以上干预并孵育24h后,行SIRT1蛋白免疫荧光染色,SIRT1及下游通路P53、乙酰化P53蛋白WB检测、倒置显微镜形态学观察、HLECs的增殖活性MTT比色法检测、HLECs凋亡水平TUNEL染色检测。结果正常对照组仅有少量SIRT1蛋白免疫荧光染色,H2O2组则明显增加,4个RES浓度组荧光进一步增强且随RES浓度上升而增加;4个NAM浓度组荧光与H2O2组比较未见明显变化。SIRT1 Western Blot检测结果与SIRT1免疫荧光染色结果一致。乙酰化P53蛋白水平随着添加RES浓度的增加而逐渐下降,随着添加NAM浓度的增加而逐渐升高。倒置显微镜观察发现,正常对照组HLECs呈较规则六角形或椭圆形,细胞密度较高;H2O2组细胞密度明显下降,少数细胞呈长梭形:加入RES后,长梭形细胞明显减少,细胞密度回升且随RES浓度上升而逐渐增加;随着添加NAM浓度的增加,细胞形态的不规则性明显增加,并出现大量长梭形细胞甚至互相联结呈网状。HLECs的MTT比色OD值随RES浓度增加而上升,RES浓度为10,20和40μmol/L时与单纯添加H2O2组比较有统计学差异(P<0.05),但RES浓度由20μmol/L上升为40μmol/L时OD值无统计学差异(P>0.05);添加NAM浓度为50,100,200μmol/L时与单纯添加H2O2组比较MTT值明显下降(P<0.05)。TUNEL检测发现,RES浓度为10,20,40μmol/L时细胞凋亡百分比与H2O2组比较显著降低(P<0.05)。添加NAM浓度为25,50,100,200μmol/L时细胞凋亡百分与H2O2组比较则显著增加(P<0.05)。结论在氧化损伤境下,HLECs中的SIRT1基因表达反应性上调;RES可通过上调SIRT1活性,减少H2O2导致的HLECs的凋亡;NAM则通过抑制SIRT1的活性,进一步加剧了HLECs的凋亡,提示SIRT1对HLECs具有抗凋亡的保护作用。第三部分在HLECs中阻断P53通路对SIRT1保护作用的影响目的应用pifithrin-a (p-fifty three inhibitor, PFT-α)阻断P53通路,观察SIRT1对HLECs的保护作用的影响,分析P53通路是否为SIRT1在HLECs中发挥保护作用的下游通路。方法体外培养HLECs SRA01/04,分为4个大组:(1)正常对照组:常规培养;(2)H202组:加入H202,终浓度为400μmol/L; (3) NAM组:加入H202及NAM溶液,H202终浓度为400μmol/L, NAM终浓度为100μmol/L; (4) PFT-α组,分设3个PFT-α浓度组:加入H202、NAM及PFT-α溶液,H202终浓度为400μmol/L, NAM终浓度为100μmol/L, PFT-α终浓度分别为2.5,5,10μmol/L。各组进行以上干预并孵育24h后,行SIRT1蛋白免疫荧光染色,SIRT1及下游通路P53、乙酰化P53蛋白WB检测、倒置显微镜形态学观察、HLECs的增殖活性MTT比色法检测、HLECs凋亡水平TUNEL染色检测。结果正常对照组仅有少量SIRT1蛋白免疫荧光染色,H202组则明显增加。NAM组及3个PFT-α浓度组的SIRT1荧光染色与H202组比较均未见明显变化。SIRT1 WB检测结果与SIRT1免疫荧光染色结果一致。与H202组比较,NAM组及3个PFT-α浓度组乙酰化P53均升高,但在这4组间无明显变化。倒置显微镜观察发现,正常对照组HLECs呈较规则六角形或椭圆形,细胞密度较高;H202组细胞密度明显下降,少数细胞呈长梭形;加入NAM后,细胞形态的不规则性明显增加,出现大量长梭形细胞;加入PFT-α后,细胞密度回升且随PFT-α浓度上升而逐渐增加,长梭形细胞明显减少,细胞形态渐趋正常。在H202培养条件下加入NAM后,HLECs的MTT比色OD值下降,但随着添加PFT-α浓度增加而回升,添加3个PFT-α浓度时与NAM组比较均有统计学差异(P<0.05)。TUNEL检测发现,在H202培养条件下添加NAM后HLECs凋亡百分比上升,随着添加PFT-α浓度的上升,细胞凋亡百分比逐渐降低(P<0.05)。结论PFT-α具有抑制HLECs细胞凋亡的作用,用PFT-α阻断P53通路可消除NAM对SIRT1保护作用的抑制,提示P53通路是SIRT1发挥保护功能的重要通路。