全球范围内,尤其在发展中国家中肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC,以下简称肝癌）属于常见的恶性肿瘤类型,在我国恶性肿瘤中排第三位,肿瘤相关死亡率中排第三位,约占85%-90%,年龄标化后的5年生存率仅为10.1%。肝癌具有较高的死亡率、复发率、转移率,故而预后不良,尽管近十年来死亡率和发病率略有下降,但仍是我国60岁以下成年男性中最常见的恶性肿瘤。在真核生物基因表达的过程中,剪接体（Spliceosome）通过剪接过程将前体信使RNA（Precursor messenger RNA,pre-m RNA）中的内含子去除、连接外显子后,pre-m RNA才能转变为成熟的m RNA,由此可见剪接体在调控遗传活动中起到重要作用。小核核糖核蛋白肽B（Small Nuclear Ribonucleoprotein Polypeptides B,SNRPB）是剪接体的核心组成部分,通过干预剪接过程参与到基因表达的转录步骤中,在生物体的生长、发育、分化、凋亡等生命过程中具有重要调节作用。SNRPB在部分恶性肿瘤中起到调控作用,但目前对SNRPB在其它恶性肿瘤中的生物学功能我们了解程度仍然有限,在肝癌的致癌机制中SNRPB的相关研究亦未见诸报道。Myc基因家族在人类超过50%的癌症的早期癌变和转移扩散进程中发挥重要作用,其家族成员c-Myc是各种人类癌症中组成性过表达最多的癌基因,且有极多致癌因子受到c-Myc的上游调节。基于生物信息学分析结果,我们判断c-Myc是SNRPB的一个上游调节因素,然而目前并未见有cMyc介导SNRPB表达的相关报道。本文拟对SNRPB在肝癌中的表达情况及对肿瘤进程的影响,c-Myc对SNRPB的调控作用进行研究,因此,我们设计以下实验:1.研究我院肝癌病理标本中SNRPB的表达情况,以及临床病理特征,结合TCGA数据库分析,评估SNRPB对肝癌生物学特性的影响;2.构建细胞模型,研究在肝癌细胞系中,c-Myc对SNRPB的介导作用,探讨二者间相互关系;3.研究肝癌细胞系中SNRPB的表达对其生物学特性的影响。第一部分:肝癌中SNRPB过表达与肿瘤恶性程度的关系目的:研究SNRPB在肝癌病理标本中的表达特点,探讨其表达水平与肿瘤恶性程度的关系。方法:1.收集2008年8月至2014年10月,广西医科大学附属肿瘤医院的154例具完整病历资料的肝细胞癌患者标本纳入本研究。患者严格按照《原发性肝癌诊疗规范》,进行TNM分期并使用Child-Pugh法对患者肝功能进行评估及分级,使用影像学方法进行诊断后行部分肝切除术,并于术后病理诊断证实为肝癌。所选病例均未经放化疗、分子靶向治疗、免疫治疗、中医药治疗等措施;2.所有患者均被告知他们的术后组织标本可能用作科学研究,征求患者同意后,我们保存了石蜡包埋的患者非肿瘤肝组织和原发性肿瘤组织;3.对石蜡包埋的癌及癌旁组织进行切片和免疫组织化学染色,以检测组织标本中SNRPB的表达水平:用石蜡组织标本构建组织微阵列,并进行免疫组织化学染色,定义染色分数的中位数并分为高表达组和低表达组,与我们在TCGA和oncomine数据库中采集的数据进行对比分析。结果:1.在本实验收集的标本中,与相匹配的癌旁组织相比,67.8%（99/146）的HCC病例中SNRPB表达增加;癌旁正常组织（距原发灶1cm）相较癌组织,SNRPB的表达增强且主要定位于细胞质中;癌组织的免疫组化评分明显高于癌旁组织,其差别有显著统计学差异（P<0.0001）;TCGA数据库来源的50对样本表明表明88%（44/50）的病例在癌症组织中伴有更多的SNRPB表达;2.SNRPB的高表达分别与患者血清AFP高水平（p=0.045）、肿瘤包膜不完整（p=0.001）、肿瘤较差分化程度（p=0.025）、肿瘤高TNM分期（p=0.005）等参数密切相关,而与患者性别、年龄、血清HBs Ag水平、肝硬化程度、肿瘤大小、肿瘤个数等参数无显著相关性。这与我们在TCGA和Oncomine数据库中收集到的相关资料统计结果相符。结论:肝癌中SNRPB表达增加,同时SNRPB的高表达与肝癌的恶性程度相关。第二部分:肝癌细胞中c-Myc正向调控SNRPB并影响细胞增殖、迁移能力目的:1.基于生物信息学结果,通过体外细胞实验研究c-Myc对SNRPB的调控作用,并对其靶向关系加以验证;2.研究SNRPB对肝癌细胞株增殖、迁移能力的影响。方法:1.收集人肝癌细胞系Hep G2和Huh7,对其进行培养及传代,构建稳定的细胞株并增殖,此后使用载体、si RNA和sh RNA转染c-Myc和SNRPB分别进入两种细胞,使用实时PCR、Western Blot蛋白印迹测试验证转染结果;2.采用c-Myc过表达载体转染Hep G2和Huh7细胞,si RNA转染c-Myc稳定过表达的Hep G2-c-Myc和Huh7-c-Myc细胞。转染36h后分别检测Hep G2-c-Myc、Huh7-c-Myc细胞和Hep G2-sic-Myc、Huh7-sic-Myc细胞中SNRPB m RNA的表达水平;检测Hep G2-c-Myc和Huh7-c-Myc细胞中SNRPB蛋白质表达水平;3.为进一步证明c-Myc可结合SNRPB启动子并转录调控SNRPB的表达,使用荧光素酶报告法检测转染36h后Hep G2-c-Myc和Huh7-c-Myc细胞中SNRPB启动子活性;4.将c-Myc抗体加入两种细胞,使用试剂盒进行染色质免疫沉淀法,通过q RT-PCR确定c-Myc与SNRPB启动子的结合情况;5.将SNRPB过表达载体及设计的两条敲降SNRPB表达的sh RNAs分别、依次转染至Hep G2和Huh7细胞中,并利用q RT-PCR技术及Western blot实验技术分别检测转染过表达载体、sh RNAs及对照组的两种细胞中SNRPB的表达量改变;6.将转染后经G418筛选出的稳定细胞约3×105个接种到6孔板中,每天记录细胞数并绘制细胞生长曲线,此后运用Transwell技术检测SNRPB对HCC细胞迁移能力的影响。结果:1.当c-Myc过表达时,SNRPB m RNA显著上调,而si RNA处理c-Myc后导致两种细胞中SNRPB m RNA表达的急剧下降;c-Myc的过表达可引起SNRPB蛋白的表达增加,c-Myc的敲低则引起SNRPB蛋白的表达下降,同时经临床病理标本的免疫组化实验验证,SNRPB的表达与c-Myc的表达呈正相关;2.sh SNRPB-1和sh SNRPB-2对HCC细胞有良好敲降效果,与对照组细胞相比,具有SNRPB过表达的细胞具有更快的生长速率,而SNRPB删失的细胞则出现增殖停滞,细胞迁移实验结果显示,迁移细胞数因SNRPB的过表达而显著增加,因SNRPB的敲低而明显减少。结论:1.c-Myc正向调控SNRPB在肝癌细胞中的表达;2.SNRPB可增强肝癌细胞的增殖、迁移能力。