真核细胞中蛋白质特异性降解主要由泛素-蛋白酶体系统（ubiquitin-proteasomesystem，UPS）完成。在这一途径中，泛素首先被泛素活化酶（E1）激活，然后被转移到泛素结合酶（E2）上；泛素连接酶（E3）识别底物和E2，并将泛素从E2上转移到目的蛋白上；目的蛋白被泛素共价修饰，进而被26S蛋白酶体识别并降解；底物上的泛素链则被去泛素化酶（DUB）解离并循环使用。已有研究报道E2，E3，DUB的功能和作用机制，但很少有系统性研究它们的调控网络的报道。本文利用PCR技术扩增卡那霉素抗性基因，并转化到酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）中，通过同源重组，分别敲除E2，E3和DUB基因。之后用G418抗性平板筛选和PCR验证，获得E2，E3，DUB基因单敲除菌种。泛素结合结构域是广泛存在于E2，E3，DUB中的结构域，用于识别并结合泛素。本文人工合成了泛素结合结构域基因Q2，通过分子克隆技术插入pGEX（kt）载体，构建原核表达质粒pGEX（kt）-4Q2。将质粒转化到大肠杆菌BL21（DE3）中， IPTG诱导表达融合蛋白，利用融合蛋白的GST标签进行纯化。本文一共获得10个E2基因单敲除菌株，23个E3基因单敲除菌株和18个DUB基因单敲除菌株，为进一步研究它们的调控网络奠定了基础。质粒pGEX（kt）-4Q2在BL21（DE3）中成功表达可溶性GST-4Q2蛋白，并成功利用GSH树脂获得纯化蛋白，从而为串联亲和纯化泛素蛋白提供技术手段。