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一实验研究第一节热休克蛋白60对小鼠树突状细胞功能影响体外研究目的:探讨动脉粥样硬化中重要炎性物质——热休克蛋白60(HSP60)体外对小鼠树突状细胞(mDC)功能影响。方法:小鼠骨髓提取DC,体外培养成熟后与两种浓度mHSP60孵育,动态观察DC突起改变;流式细胞仪检测孵育前后mDC表面标志改变;MLR测定孵育前后mDC刺激功能变化;ELISA法测定MLR上清液中细胞因子浓度。结果:孵育后,mDC突起增加明显;CD11c+、CD80及CD86表型显著增加;淋巴细胞刺激功能明显增强;分泌细胞因子IL-12、IFN-γ增加(P<0.01)而IL-4增加不明显(P>0.05),IFN-γ/IL-4比值升高。结论: mHSP60体外可以促进mDC功能,作用呈剂量依赖性。第二节过继负载HSP60的致耐受性DC对小鼠血管内皮功能的影响目的探讨负载热休克蛋白60(HSP60)的致耐受性树突状细胞(DC)接种对ApoE-/-小鼠血管内皮功能的影响。方法分离ApoE-/-小鼠骨髓DC,分别用HSP60和HSP60加雷帕霉素处理DC,分别获得负载HSP60 DC(DChsp)和致耐受DC(DChsp+r)。体外检测各组DC的功能。分别用DChsp,DChsp+r和盐水经静脉接种高脂饲养ApoE-null小鼠,共两次;设C57BL/6小鼠为未接种正常对照。末次接种后两周检测T细胞对HSP60的反应和主动脉环的内皮依赖性舒张功能。结果体外HSP60可促进DC表达CD86及刺激淋巴细胞增殖,而致耐受DC其CD86表达显著下降。接种小鼠后,DChsp促进炎性反应,加重内皮舒张功能障碍;而DChsp+r明显抑制炎性反应,增强内皮舒张功能。结论热休克蛋白60致耐受性树突状细胞接种可抑制HSP60特异性免疫应答,增强血管内皮舒张功能。第三节负载热休克蛋白60的致耐受性树突状细胞对小鼠动脉粥样硬化斑块的影响目的探讨负载热休克蛋白60(HSP60)的致耐受性树突状细胞(DC)接种对ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块的影响。方法制备ApoE-/-小鼠骨髓DC,分别用HSP60或HSP60加雷帕霉素(rap)处理获得DCHSP60和rap-DCHSP60,体外检测各组DC功能。分别用CFSE染色的DCHSP60和rap-DCHSP60及PBS经静脉接种高脂饲养ApoE-/-小鼠3次,末次接种后8W观察各组斑块面积,CD4+T细胞和DC在斑块中浸润情况及脾细胞对HSP60的反应。结果体外HSP60负载DC CD86表达显著高于未负载DC,而致耐受DC CD86表达显著低于未负载DC。接种小鼠后,DCHSP60组斑块中炎性细胞浸润明显多于PBS组,DCHSP60组斑块面积大于PBS组;而rap-DCHSP60组炎性细胞浸润明显减少,斑块面积显著小于PBS组;HSP60刺激脾细胞后,,DCHSP60组IFN-γ分泌增加,而rap-DCHSP6组IL-10分泌增加,反应呈抗原特异性。结论负载HSP60的耐受性DC接种可抑制HSP60特异性免疫反应,抑制动脉粥样斑块中的炎症反应和斑块的进展。二临床研究第一节不稳定型心绞痛患者树突状细胞的功能目的研究不稳定型心绞痛患者(UAP)树突状细胞(DC)的功能,探讨其与UAP时炎性反应的关系。方法分离34例UAP和21例正常人外周血单个核细胞(PBMC),在含粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白介素4(IL-4)的培养条件下制备DC。用流式细胞仪检测DC表面共刺激分子CD86(B7-2)的表达;混合淋巴细胞反应(MLR)检测DC对同种异体T淋巴细胞的刺激能力;ELISA法测定MLR上清液中的细胞因子;探讨CD86表达与冠心病危险因素的相关性。结果与对照组比较,UAP者DC表面CD86的表达明显增高(P<0.01);对T淋巴细胞刺激的能力增强;经DC刺激的淋巴细胞分泌致炎细胞因子(IL-1β,IL-6,TNF-a)增多,抑炎细胞因子(IL-10)减少,P<0.001;CD86的表达与血LDL-C水平正相关(r=0.63,P<0.01)。结论UAP者DC的功能亢进,由此启动的T淋巴细胞的增殖和炎性细胞因子分泌可能是UAP者动脉斑块不稳定的原因。第二节不稳定型心绞痛患者树突状细胞介导的HSP60特异性细胞毒作用目的探讨不稳定型心绞痛(UAP)患者体内是否存在树突状细胞(DC)介导的HSP60特异性的T细胞毒反应。方法分离UAP,稳定型心绞痛者和正常人外周血单核细胞,制备DC。流式细胞仪检测HSP60负载及未负载的DC CD86的表达及各组T细胞中CD45RO+细胞的百分比;MTT法检测各组DC刺激自体淋巴细胞增殖的能力,并检测各组DC诱导的细胞毒T细胞(CTL)对负载HSP60的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的杀伤活性;ELISA法测定HSP60冲击T细胞后干扰素γ的分泌。结果与未负载HSP60的稳定型心绞痛者和正常人的DC比较,UAP者的DC以及负载HSP60的正常人的DC CD86表达较高; UAP者的DC及HSP60负载的DC刺激自体CTL增殖的能力增强; UAP者的DC及HSP60负载的DC诱导的CTL对负载HSP60的HUVECs有高度的杀伤作用; UAP者体内存在HSP60致敏的记忆性T细胞。结论UAP者体内存在强烈的DC介导的HSP60抗原特异性T细胞毒反应。第三节阿托伐他汀对不稳定型心绞痛患者树突状细胞功能的影响目的研究不稳定型心绞痛患者(UAP)树突状细胞(DC)的功能及阿托伐他汀对其的影响。方法将34例UAP分为常规治疗组(17例)和常规加阿托伐他汀治疗组(17例),分别于治疗前及治疗后2周取血分离外周血单个核细胞,在含粒细胞巨噬细胞集落刺激因子和白介素4的培养条件下制备DC。用流式细胞仪检测DC表面共刺激分子CD86(B7-2)的表达;混合淋巴细胞反应(MLR)检测DC对同种异体T淋巴细胞的刺激能力;ELISA法测定MLR上清液中的细胞因子;探讨CD86表达与冠心病危险因素及C反应蛋白(CRP)的相关性。结果与正常对照组比较,UAP者DC表面CD86的表达明显增高;对T淋巴细胞刺激的能力增强;经DC刺激的淋巴细胞分泌致炎细胞因子(IL-1β,IL-6,TNF-a)增多,抑炎细胞因子(IL-10)减少;用药前CD86的表达与血LDL-C水平正相关;阿托伐他汀抑制DC功能的同时显著降低血CRP水平;且CD86与CRP水平正相关。结论1. UAP者DC的功能亢进,由此启动的T淋巴细胞的增殖和炎性细胞因子分泌可能是UAP者动脉斑块不稳定的原因,2. LDL-C可能是其刺激因素;3.阿托伐他汀抑制斑块炎症的机制之一是其对DC的抑制。