目的:生长阻断及DNA损伤诱导因子45b(Growth arrest and DNA-damage inducible protein beta,Gadd45b)属于Gadd45家族,被证实与神经元活动有关,这与神经的发生密切的相关。大鼠的脑缺血再灌注损伤可以诱导Gadd45b在蛋白和核酸水平的表达,Gadd45b介导了神经元的凋亡,可能与轴突可塑性和卒中后脑康复有关。细胞的死亡方式包括了凋亡、自噬和坏死。自噬性细胞死亡作为II型程序性细胞死亡,被证实参与了脑缺血再灌注损伤这一病理过程。然而,在此病理过程中Gadd45b对自噬的作用并不清楚。此外,在脑缺血中,Gadd45b可以促进脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)的表达,与轴突的可塑性而相关,Gadd45b在脑缺血中可能起着促进康复的作用。然而,在脑缺血病理过程中,Gadd45b表达的分子调控机制尚不清楚。泛素-蛋白酶系统(Ubiquitin-proteasome system,UPS)广泛调控了细胞内蛋白的降解。Gadd45的表达受到了泛素化方式的调控。但是,脑缺血再灌注损伤如何诱导Gadd45b表达及所涉及的具体机制也不清楚。本研究以进一步探讨和分析在脑缺血再灌注损伤的病理过程中Gadd45b对自噬的作用和可能的作用机制,以及泛素化系统Huwe1对Gadd45b的作用,以及两者在卒中后脑可塑性中的作用机制。方法:采用大鼠皮层神经元原代培养,并予以缺氧缺糖/再灌注处理(oxygen-glucosedeprivationandreperfusion,ogd/r),即ogd3h和再灌注0h、6h、24h、48h、72h和120h。cck-8和ldh试剂盒用于检测皮层神经元的细胞活性和损伤情况。构建慢病毒shrna-gadd45b沉默gadd45b的表达,利用蛋白印迹技术检测自噬分子(atg5、lc3、beclin-1、atg7、atg3)、凋亡通路分子(bax、bcl-2、cleavedcaspase3、p53)以及jnk/p38信号通路的表达变化。同时,给予自噬抑制剂或jnk/p38通路抑制剂共处理,检测相关分子的蛋白表达变化情况,并利用tunel技术检测皮层神经元细胞的凋亡情况。利用神经元标记物tuj1和lc3b免疫荧光染色双标技术检测神经元的轴突损伤。此外,构建慢病毒shrna-huwe1沉默huwe1的表达变化,采用co-ip检测huwe1和gadd45b的相互作用,进行chx处理检测huwe1对gadd45b蛋白稳定性的分析,采用bsp检测huwe1和gadd45b对bdnfixa甲基化的作用,采用westernblot技术检测huwe1和gadd45b对bdnf及其受体trkb和p75ntr和下游效应分子的影响。结果:在ogd/r处理神经元细胞后,皮层神经元的细胞活性降低,随着再灌注时间的延长而逐渐降低。gadd45b在ogd/r24h时表达最高,给予慢病毒shrna沉默gadd45b后,gadd45b在再灌注24h时表达明显的降低,增加了自噬通路的信号分子(beclin-1、atg5、atg7和atg3)、lc3ii/lc3i的比值和凋亡蛋白bax和cleavedcaspase3的表达,但是降低了抗凋亡蛋白Bcl-2的表达。与此同时,慢病毒shRNA-Gadd45b和自噬通路抑制剂3-MA或Wortmannin共处理后,可部分抑制LC3 II/LC3 I的比例,轻微缓解了神经元的凋亡。沉默Gadd45b表达后,自噬相关通路p-p38磷酸化水平降低,而凋亡相关通路p-JNK磷酸化水平增加。给予慢病毒shRNA-Gadd45b和p38通路抑制剂共处理后则明显诱导了自噬,而给予慢病毒shRNA-Gadd45b和JNK通路抑制剂共处理后则明缓解了细胞凋亡。OGD/R 24 h后,沉默Huwe1表达后明显增加了Gadd45b和BDNF的表达。CO-IP结果表明Huwe1和Gadd45b存在相互作用。通过CHX处理后抑制了内源性的Gadd45b的表达,CHX和慢病毒shRNA-Huwe1共处理后则增加了Gadd45b的表达。慢病毒shRNA-Gadd45b处理后降低了BDNF和下游效应分子的表达,而慢病毒shRNA-Huwe1处理后增加了BDNF和下游效应分子表达。沉默Huwe1表达后降低了BDNF IXa第五个CpG岛甲基化水平,而沉默Gadd45b表达后则增加了BDNF IXa第四个CpG岛甲基化水平。结论:在皮层神经元OGD/R的病理过程中Gadd45b调节了凋亡和自噬,Gadd45b的表达受到了泛素-蛋白酶体系统Huwe1的调节,Gadd45b和Huwe1介导了BDNF IXa的甲基化。这可能为缺血性脑卒中的病理过程的研究提供新的理论基础,为日后的临床治疗提供可能的靶点。