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HD-Zip是植物特有的转录因子家族,其参与植物光合作用、形态发育等多个生物学过程。前期生物信息学分析发现,该基因家族的HAT22可能参与了植物次生细胞壁的形成,为了验证HAT22是否参与了植物次生细胞壁的形成,本文从木本转基因植物中的模式植物毛果杨(Populus trichocarpa)中克隆得到了HAT22的同源基因,并对其组织表达特异性、转录因子基本特性以及在杨树次生细胞壁形成中的生物学功能进行了研究,主要研究结果如下。1.克隆了毛果杨HAT22全长为822 bp的CDS序列,将其命名为PtrHAT22。PtrHAT22编码273个氨基酸,其蛋白具有家族典型HD及Zip结构域,在17-21氨基酸序列处具有LxLxL抑制结构域。毛果杨HD-Zip转录因子家族进化树分析发现,HD-Zip转录因子家族中大多数成员间具有较高的同源性。2.通过对qRT-PCR实验结果分析,PtrAT22能够在毛果杨的根;初生叶片;过渡叶片;次生叶片;过渡韧皮部;次生韧皮部;初生木质部;过渡木质部;次生木质部组织中表达,其可能参与植物多个器官和组织的发育过程。在所有进行实验的组织中,PtrHAT22在木质部的表达量最高,表明PtrGAT22的主要功能可能是参与次生细胞壁合成。为了确定该基因在植物哪些组织中表达,我们进行了PtrHAT22启动子加GUS基因烟草瞬时侵染的染色分析,次生茎部、根部和叶脉处染色较深,表明该基因主要在植物次生细胞壁形成活跃的组织表达,这与qRT-PCR研究结果基本一致。3.亚细胞定位研究表明,PtrHAT22是定位于细胞核符合大多数转录因子定位于细胞核的特性。转录激活研究发现,PtrHAT22无自激活性。酵母杂交试验发现,PtrHAT22能够与前期预测的下游调控靶基因MYB46、MYB58以及C2H2启动子相结合。通过对下游其他靶基因启动子元件分析,选择出上述基因高频率元件及与木质素合成相关的元件,对其进行酵母杂交试验,结果表明,PtrHAT22能够与AC-II、Box4、TATA-box和G-Box元件特异性结合。4.对PtrHAT22过表达及野生型毛果杨营养生长统计,与野生型毛果杨相比转基因植株OE-2、OE-3、OE-6在株高分别降低了 9.37%、14.9%、28.67%;地径分别降低了10.73%、9.98%、27.34%;茎节数分别降低了 23.61%、12.50%、34.72%;干重分别降低了 36.79%、34.28%、48.06%;鲜重分别降低了 24.51%、21.88%、39.21%;叶片长度分别降低了 40.00%、46.67%、57.78%;叶片宽度分别降低了 50.48%、47.62%、64.76%,转基因株系株高、地径、茎节数、干重鲜重及叶片大小均有显著降低,PtrHAT22对杨树的营养生长具有抑制作用。5.PtrHAT22过表达毛果杨细胞壁主要组分含量测定发现,转基因株系与对照相比,木质素含量降低17.15%,纤维素含量降低10.95%,半纤维素含量上升14.68%。同时,纤维的长度下降了 2.46%,宽度下降了13.01%。为研究纤维素、半纤维素、木质素及纤维长、宽的变化,会对植物细胞壁的厚度产生哪些影响我们进行了扫描电镜实验,转基因株系次生细胞壁厚度下降了 36.29%。过表达转基因株系次生细胞壁形成相关基因qRT-PCR分析表明,纤维素合成基因CesA4、CesA 7、CesA 8表达量显著下降,半纤维素合成基因IRX9表达量显著下降而IRX10川的表达量升高,木质素合成基因PAL1的表达量降低,PAL4、HCT1、CSE2、C4H2、COMT2、CAD1、CCR2、CCoAOMT1 表达量显著下降,与PtrHAT22具有结合能力基因PtrMYTB46、PtrMYB58、PtrYB282表达量显著下降,上述基因的表达变化与次生细胞壁组分含量的变化基本一致,表明PtrHAT22通过直接或间接调控上述基因的表达影响了植物次生细胞壁的形成。