研究背景：在全球范围内肺癌是人类发病率及致死率最高的恶性肿瘤。其中非小细胞肺癌占所有肺癌病例近85%,肺腺癌为最常见的病理类型之一。近年来由于外科技术及新辅助放化疗的普及应用,为肺癌的临床治疗提供了新的策略,但非小细胞肺癌患者的预后仍未得到根本改善,其5年生存率仅为14%-17%。从分子水平上深入认识肿瘤细胞的发生发展依然是胸外科学函待解决的重要课题,有助于为我们发展抗癌新策略和靶点分子提供重要的理论依据。肿瘤的发生发展过程涉及一系列重要分子和信号通路,如BRCAl,Kras蛋白、P53信号途径、PI3K/AKT/mTOR信号通路等。这些分子及其信号通路的异常调控可使肿瘤细胞获得恶性行为能力,如异常增殖能力,抗细胞凋亡机制,肿瘤的侵袭转移能力,在此过程中核糖体功能的异常活跃对肿瘤细胞快速合成增殖及其他恶性表型所需的功能蛋白尤为重要核糖体是蛋白质合成场所,在真核细胞中为80S,包括60S的大亚基和40S的小亚基,均由核糖体RNA (rRNA)和核糖体蛋白(Ribosomal Protein, RP)构成。迄今,人们已发现约80种真核细胞核糖体蛋白,这些核糖体蛋白中大多数通过与rRNA的特定区域以非共价键结合,从而在翻译过程中调控蛋白质合成。近年来有大量研究报道核糖体蛋白的核糖体外功能,如在DNA修复,分化,组织发育,细胞凋亡及转录调控等细胞生理活动中,核糖体蛋白具有重要的调控作用。而某些核糖体蛋白的异常调控被发现与人类恶性肿瘤的发生发展密切相关。例如,核糖体蛋白RPL22过表达与非小细胞肺癌的发生发展密切柑关,而RPSL26与RPLL29的下调可显著抑制胰腺癌细胞的增殖。RPS15A是进化上呈高度保守的基因,在人类基因组中位于16p12.3,负责编码核糖体40S小亚基的核心部件-RPS15A蛋白。在肽链合成起始阶段,RPS15A通过与真核翻译起始因子eIF-4F相互作用,从而促进]mRNA与核糖体的结合形成起始复合物。在植物组织中RPS15A蛋白在分裂活动旺盛的未成熟组织中呈高表达,而在已分化发育成熟的细胞中表达水平明显降低,以上研究结果表明：RPS15A对于细胞增殖具有促进功能。此外,在酵母细胞中,RPS15A的过表达可逆转cdc33基因(在酵母细胞中编码eIF-4F)突变诱导的G1/S期细胞周期阻滞,表明RPS15A可促进细胞周期的过度。最近,在乙型病毒性肝炎的相关研究中发现：RPS15A的过表达促进细胞周期过度,加快肝细胞增殖,介导肝细胞炎癌转变进程。而RNAi介导的RPS15A下调则显著抑制肝癌细胞增殖,表明RPS15A与肝癌发生密切相关。此外,在早期的研究中发现RPS15A为转化生长因子β1 (TGF-β1的下游应答因子之一。这些结果均表明：rpal5a基因的调控异常与肿瘤细胞的发生发展有密切的相关性,但该基因在肺癌中的功能作用及其分子机制,迄今尚未见报道。研究方法：临床相关性研究：为了探讨RPS15A蛋白表达与非小细胞肺癌发生的临床相关性,我们应用了组织芯片,通过免疫组化分析,对微阵列中RPS15A的蛋白表达情况进行统计学分析。我们收集了2005年7月至2011年12月在吉林大学第二医院胸外科接受肺癌根治术的75例肺腺癌患者的组织样本。本研究中所涉及的临床相关性研究工作均得到吉林大学第二医院伦理委员会的许可,并征得患者知情同意书。该研究所用的标本所述患者均无术前放、化疗史。同时,我们收集了癌旁组织作为实验对照组。为了高通量分析组织样本中RPS15A蛋白的表达情况,我们应用了组织芯片技术,对150例组织样本(75例癌组织及75例癌旁正常组织)进行免疫组化检测。收集的组织样本由上海卓立生物技术有限公司制备肿瘤组织芯片。进行免疫组化检测时将组织芯片从冰箱中取出放置于玻片架上复温至室温,然后60℃左右烘烤3小时,将表面的封蜡融掉。组织芯片脱蜡、水化、抗原热修复,免疫组化染色,显微照相系统处理结果。阴性对照组置于无一抗的溶液中。由吉林大学第二医院病理科及中心实验室三位老师负责对免疫组化结果进行独立分析。体外水平恶性功能表型实验：为了在体外水平检测RPS15A在肺癌细胞的恶性行为能力的功能作用,我们选取不同肺癌细胞系,包括肺腺癌细胞系H1299和A549,肺鳞状细胞癌SK-MES-1细胞系以及小细胞肺癌细胞系H1688。RNA干扰技术,作为功能基因组学强有力的工具,为我们探索肿瘤相关基因提供了新的方法。为了获得RPS15A下调的稳转细胞,在本课题中我们通过分子生物学克隆技术构建含有RPS15A特异性shRNA片段的慢病毒质粒。经测序结果分析后,将含有shRNA慢病毒质粒与其他包装质粒共转染至293T细胞中,48小时后收集病毒悬液,得到含有shRPS15A的慢病毒,命名为Lv-shRPS15A。病毒阴性对照组为Lv-shCon。随后将收集的病毒以10和20的病毒滴度值感染肺腺癌细胞系H1299和A549细胞。为了验证病毒转染效率及RPS15A基因下调水平,我们在荧光显微镜中观察细胞中GFP荧光表达情况,并应用实时定量PCR检测RPS15A基因mRNA水平。RPS15AmRNA表达水平通过与内参GAPDH进行相对计算。随后我们运用western blotting方法检测病毒转染前后的RPS15A蛋白质水平。为了探讨RPS15A的表达水平是否影响肺腺癌增殖能力与克隆形成能力,我们在指数生长的癌细胞中进行了MTT增殖实验及克隆形成实验。为了检测RPS15A下调对细胞凋亡及细胞周期分布情况,我们运用流式细胞术检测凋亡细胞及处于不同细胞周期的肿瘤细胞。功能基因下游机制实验：为了探究RPS15A影响肺腺癌恶性行为能力的分子机制及其下游调控因子,我们应用cDNA表达谱芯片检测RPS15A下调引起的基因表达变化。通过对显著变化的基因进行聚类分析,初步了解RPS15A沉默对其他基因的调控作用。随后我们将数据上传到KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)数据库,对基因谱表达变化进行通路聚类分析。为了验证RPS15A诱导的基因表达调控,我们通过Western Blotting方法检测了通路中关键因子的表达水平。研究结果RPS15A在肺腺癌组织中异常高表达：为了检测RPS15A的临床相关性,我们应用组织芯片技术在75例肺腺癌患者样本中进行免疫组化染色。我们发现RPS15A主要表达于细胞浆内。在癌组织与癌旁组织中RPS15A阳性率分别为66.7%(50/75)和42.7%(32/75)。RPS15A在癌组织与癌旁组织中的表达具有统计学差异(P<0.001),表明RPS15A在癌组织中显著高表达。随后我们将肺癌组织样本依据患者的临床特征性指标分组,并与RPS15A表达水平进行相关性分析。我们的数据分析表明RPS15A与患者的年龄,肿瘤病理分级,TNM分期,肿瘤大戏及淋巴结转移发生无显著性差异。为了探讨RPS15A表达水平是否与肺腺癌患者的预后相关,我们绘制了Kaplan-Meier生存曲线。Kaplan-Meier生存曲线显示RPS15A与患者生存期无显著相关性。慢病毒诱导的RPS15A基因表达下调：我们通过实时定量PCR检测了不同肺癌细胞系中RPS15A基因的基础表达水平。我们发现RPS15A的mRNA在癌组织中均有显著的表达,均高于内参GAPDH的表达。如上文所述,我们通过三质粒包装体系,收集到含有RPS15A特异性shRNA的慢病毒,并转染肺腺癌细胞系。为了检测慢病毒介导的RPS15A下调效率,在转染72小时后我们在荧光显微镜中观察了GFP蛋白表达,发现逾80%的肿瘤细胞。随后,我们应用实时定量PCR方法和western blotting实验检测该基因在mRNA及蛋白水平的下调情况。结果发现被Lv-shRPS15A转染的A549和H1299细胞中RPS15A被显著下调。这些实验结果均表明慢病毒转染Lv-shRPS15A诱导肿瘤细胞中RPS15A沉默。RPS15A敲减抑制肺癌细胞恶性增殖能力及克隆形成能力：在MTT实验中我们发现从病毒转染48h,72h,96h以及120 h后,肺腺癌细胞H1299及A549细胞的增殖能力与对照组相比显著降低,表明RPS15A下调抑制肿瘤细胞的增殖能力。同样,在克隆形成实验中被Lv-shRPS15A转染的细胞与对照组相比起克隆形成能力显著降低,表现为克隆形成数量与克隆大小等,表明RPS15A沉默削弱肿瘤细胞克隆形成能力。RPS15A沉默触发肿瘤细胞发生凋亡及细胞周期阻滞：为了初步了解RPS15A对肺腺癌细胞H1299及A549细胞凋亡的影响,我们应用流式细胞分析仪,检测被Annexin V-APC染色的细胞。流式细胞分析结果显示RPS15A下调触发细胞发生凋亡。同时我们检测了RPS15A敲减后肿瘤细胞在不同细胞周期中的分布情况。我们发现RPS15A引起细胞周期阻滞,表现为G0/G1期和S期细胞百分比显著升高。由此我们提出RPS15A沉默可以诱导细胞发生凋亡及细胞周期阻滞,藉此抑制肿瘤细胞的恶性增殖及克隆形成能力。RPS15A下调激活肿瘤细胞P53信号通路,并改变细胞谷氨酰胺代谢途径中调控因子的表达水平：如上文所述,为了研究RPS15A沉默抑制肺癌细胞的分子机制,我们应用基因表达谱芯片,对受RPS15A调控的下游基因进行检测分析。我们的结果表明RPS15A在肿瘤细胞中的沉默导致了885种基因的表达上调和566种基因的下调。随后我们进行GO基因功能分子聚类分析发现受RPS15A基因调控的基因多属于在细胞中参与蛋白合成及生物聚合体、大分子代谢产物的基因。功能上这些基因主要参与DNA结合,阳离子结合及酶蛋白的活性调控的细胞生理活动。KEGG信号通路富集分析结果显示RPS15A沉默可诱导P53信号通路的激活。为了验证表达谱芯片中受到RPS15A调控基因的变化,我们进行了western blotting实验检测了P53信号通路中的关键因子。Western blotting实验结果表明RPS15A沉默显著抑制了SESN2的表达,同时上调了P21和TP5313的表达水平。这些数据与基因表达谱芯片结果一致。此外,基因表达谱芯片结果显示,RPS15A调控ATF4下游蛋白及谷氨酰胺调控途径中关键因子的表达。研究总结深入了解肿瘤发生发展的分子机制,无疑对我们寻找最佳治疗方法具有重要意义。此外,目前有大量证据表明,对其分子机制深入研究可以促进开发出特异性杀伤恶性细胞的靶向治疗药物。这种新的治疗技术旨在肿瘤分子生物学的理论基础上,与肿瘤相关的特异性分子作为靶点,对其进行治疗,相对于肿瘤的传统治疗手段具有其独特的优势。因此在分子水平上深入认识肺癌发生发展的分子机制是现阶段针对非小细胞肺癌的靶向治疗函待解决的重要问题。早期在斑马鱼模型的研究中人们发现很多核糖体蛋白与肿瘤发生密切相关。核糖体蛋白广泛表达于机体绝大部分组织细胞内,在进化过程中高度保守。在蛋白质翻译早期阶段核糖体蛋白与核糖体RNA相互作用,组成核糖体,为蛋白质合成提供重要场所。值得注意的是,近年来有大量研究报道核糖体蛋白的核糖体外功能,如在DNA修复,分化,组织发育,细胞凋亡及转录调控等细胞生理活动中核糖体蛋白具有重要的调控作用。而某些核糖体蛋白的异常调控被发现与人类恶性肿瘤的发生发展密切相关。例如,核糖体蛋白RPL22过表达与非小细胞肺癌的发生发展密切相关,而RPSL26与RPLL29的下调可显著抑制胰腺癌细胞的增殖。作为核糖体20S亚基的组成元件,RPS15A在翻译起始阶段可以与核糖体RNA相互作用共同催化翻译起始复合物的形成。最近有研究表明在肝细胞中敲减RPS15A的mRNA表达水平可以显著抑制肝癌细胞生长能力,表明RPS15A在肝癌发展进程中扮演着重要的角色。然而迄今尚未报道RPS15A在肺癌中的调控作用及其分子机制。为了检测RPS15A在肺腺癌组织中的表达水平,我们收集了75例癌组织与癌旁组织制备组织芯片,我们的为了检测RPS15A的临床相关性,我们应用组织芯片技术在75例肺腺癌患者样本中进行免疫组化染色。在癌组织与癌旁组织中RPS15A阳性率分别为66.7%(50/75)和42.7%(32/75)。RPS15A在癌组织与癌旁组织中的表达具有统计学差异(P<0.001),表明RPS15A在癌组织中显著高表达。随后我们通过三质粒包装体系,收集到含有RPS15A特异性shRNA的慢病毒,并转染肺腺癌细胞系。通过MTT实验,我们发现RPS15A下调抑制肿瘤细胞的增殖能力。同样,在克隆形成实验中被Lv-shRPS15A转染的细胞与对照组相比起克隆形成能力显著降低,表现为克隆形成数量与克隆大小等,提示RPS15A沉默削弱肿瘤细胞克隆形成能力。此外,流式细胞分析结果显示RPS15A下调触发细胞发生凋亡。同时我们检测了RPS15A敲减后肿瘤细胞在不同细胞周期中的分布情况,发现RPS15A引起细胞周期阻滞,表现为G0/G1期和S期细胞百分比显著升高。为了研究RPS15A沉默抑制肺癌细胞的分子机制,我们应用基因表达谱芯片,检测受RPS15A调控的下游基因。KEGG信号通路富集分析结果显示RPS15A沉默可诱导P53信号通路的激活。为了验证表达谱芯片中受到RPS15A调控基因的变化,我们进行了western blotting实验检测了P53信号通路中的关键因子。Western blotting实验结果表明RPS15A沉默显著抑制了SESN2的表达,同时上调了P21和TP5313的表达水平。这些数据与基因表达谱芯片结果一致。此外,同时,我们还发现RPS15A沉默引起蛋白质翻译功能相关基因的下调,并抑制ATF4下游靶基因及谷氨酰胺代谢过程中起着重要调控作用的tRNA合成酶及氨基酸运载体的表达水平。ATF4,又名CREB2 (cAMP反应元件结合蛋白2),是ATF/CREB蛋白家族中的重要成员。ATF4基因的mRNA广泛存在于机体内,当细胞处于氧化应激和氨基酸缺失及内质网应激等应激状态时,ATF4蛋白表达上调,并通过激活自身转录活性,诱导参与氨基酸代谢和氧化还原反应的靶基因表达上调。其下游靶基因包括谷氨酰胺代谢途径重要酶类蛋白调控因子ASNS, PCK2, GPT2, PHGDH, PSPH蛋白和tRNA合成酶CARS, GARS, MARS及氨基酸运载体SLC1A3, SLC1A4, SLC1A5等,均在细胞谷氨酰胺代谢途径中起着重要的调控作用。其中ASNS作为ATF4直接下游靶点,反应ATF4的转录活性34。如上文所述,在前期工作中我们发现RPS15A抑制ATF4下游靶基因的表达,并上调P53信号通路中关键调控因子的转录水平。基于以上研究结果分析,我们提出：RPS15A在肿瘤细胞氨基酸代谢过程中扮演着重要角色,在肿瘤细胞中往往过表达,并参与调控肿瘤细胞异常的谷氨酰胺代谢途径；通过开关效应,即RPS15A基因的下调抑制ATF4的表达或削弱其转录活性,从而阻断肿瘤细胞异常的谷氨酰胺代谢旁路激活,而同时特异性激活P53信号途径,藉此达到抑制肿瘤细胞的增殖及其他恶性行为能力。