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研究背景蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage,S AH)是一种以高死亡率和残疾率为特点的严重脑血管疾病。大量的研究已经表明早期脑损伤(EBI)是蛛网膜下腔出血后不良结局的主要原因,然而早期脑损伤的确切机制仍然存在争议。在涉及的多种机制中,细胞凋亡被认定在早期脑损伤病理过程中发挥重要作用。越来越多的研究表明抑制神经细胞凋亡可缓解蛛网膜下腔出血后早期脑损伤并改善神经功能。因此,需要更进一步探索凋亡的机制及其上游信号调控通路,从而开发新的治疗方法以改善蛛网膜下腔出血后患者的预后。磷酸二酯酶-4(Phosphodiesterase 4,PDE4)是一种高亲和力的酶,能够特异性水解cAMP的功能,其通常作为第二种信使调解一些细胞进程。之前研究表明,在脊髓损伤,缺血性中风和阿尔茨海默病等一系列中枢神经系统损伤中,药物抑制PDE4可发挥重要的神经保护作用。近年来尽管大量的研究已经表明磷酸二酯酶-4介导了脑损伤,但是潜在的机制尚未完全了解。最近的研究表明磷酸二酯酶-4能够调节Sirtuin1(SIRT1)的表达和功能。SIRT1是(NAD+)依赖性蛋白脱乙酰酶的成员。越来越多的证据表明SIRT1可以通过脱乙酰化其靶蛋白调节多种类型的细胞功能,其靶蛋白包括p53,Fox03,IRS-2和核因子κB(NF-κB);同时,最新研究发现SIRT1过表达可以增加Akt的活性,SIRT1/Akt信号通路的激活会通过增强新生毛细血管生成对抗血栓形成,同时在脑卒中脑损伤后发挥神经保护作用。然而,PDE4和SIRT1/Akt通路在SAH之后病理生理过程中具体的作用及其机制仍不清楚。因此,本研究的目的是研究通过咯利普兰抑制PDE4来改善蛛网膜下腔出血后的脑损伤,并探讨SIRT1/Akt通路在抑制PDE4后介导的神经保护作用中的机制,最终探索治疗蛛网膜下腔出血的新靶点和新方法。实验方法第一部分1.蛛网膜下腔出血(SAH)模型的建立采用的是线栓穿刺法,随机将成年雄性SD大鼠分为假手术组(Sham组),蛛网膜下腔出血组(SAH组);根据构建模型取标本时间不同,将SAH组分为SAH3h组(蛛网膜下腔出血后3小时组)、SAH6h组(蛛网膜下腔出血后6小时组)、SAH12h组(蛛网膜下腔出血后12小时组)、SAH24h组(蛛网膜下腔出血24小时组)、SAH48h组(蛛网膜下腔出血48小时组)和SAH72h组(蛛网膜下腔出血后72小时组)。利用免疫印迹法检测磷酸二酯酶-4(PDE4)及SIRT1/Akt通路相关蛋白表达水平(SIRT1、p-Akt、Akt)。采用免疫荧光双标染色法观察各类神经细胞中磷酸二酯酶-4(PDE4)的表达分布情况。第二部分1.首先在SD成年雄性大鼠上构建SAH模型,2小时后采用腹腔注射法分别给予溶剂和咯利普兰,随机分为假手术组、SAH+溶剂组和SAH+咯利普兰组。2.在SAH后24小时,统计各组大鼠蛛网膜下腔出血评分,评估各组大鼠神经功能障碍程度(Garcia量表),使用干湿重法测定各组大鼠脑组织水含量,采用TUNEL荧光染色法测定各组大鼠神经细胞凋亡水平,应用免疫印迹法检测各组大鼠磷酸二酯酶-4(PDE4)及SIRTl/Akt通路相关蛋白表达水平(SIRT1、p-Akt、Akt),细胞凋亡相关蛋白(Cleaved Caspase-3、Bcl-2、Bax)的表达水平。综合上述结果评估利用咯利普兰抑制PDE4是否具有的神经保护作用。第三部分1.首先在SD成年雄性大鼠上构建SAH模型,2小时后利用腹腔注射法分别给予溶剂和咯利普兰,最后两组给药组需要在立体定位下侧脑室注射法分别给予适宜剂量SIRT1特异性抑制剂sirtinol(术前2小时)和Akt抑制剂MK2206(术后1小时),将实验大鼠随机分为SAH+溶剂组、SAH+咯利普兰组、SAH+咯利普兰+ sirtinol组和SAH +咯利普兰+ MK2206组。2.在SAH后24小时,评估各组实验大鼠神经功能障碍程度(Garcia量表),使用干湿重法测定各组大鼠脑组织水含量,使用TUNEL荧光染色法测定神经细胞凋亡水平,使用免疫印迹技术检测各组大鼠磷酸二酯酶-4(PDE4)及SIRT1/Akt通路相关蛋白表达水平(SIRT1、p-Akt、Akt),凋亡相关蛋白(Cleaved Caspase-3、Bcl-2、Bax)的表达水平。探索PDE4抑制剂咯利普兰对蛛网膜下腔出血的神经保护作用具体机制。结果第一部分在实验大鼠的皮层脑组织中,免疫印迹法检测结果显示SAH模型构建后磷酸二酯酶-4(PDE4)和p-Akt的表达水平显著降低,并于24小时达到低峰;SIRT1表达水平显著升高,于24小时达到最高峰;对SAH后24小时的大鼠皮层脑组织进行免疫荧光双重染色结果显示,其中磷酸二酯酶-4(PDE4)与神经元标记蛋白NeuN(neuronspecific nuclear protein)存在明显的共表达;此外,PDE4与小胶质细胞标记蛋白 Iba-1(ionized calcium binding adapter molecule 1)及星形胶质细胞标记蛋白GFAP(Glial fibrillary acidic protein)存在少量的共表达。第二部分1.构建SAH模型后24小时与Sham组相比,大鼠的脑组织水肿程度与神经功能障碍明显增加;免疫印迹提示其皮层脑组织中的促凋亡蛋白Cleaved Caspase-3和Bax表达明显升高,抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平明显降低;TUNEL荧光染色提示其皮层脑组织中TUNEL阳性细胞数目明显增加。2.在构建SAH模型后,使用咯利普兰可显著抑制PDE4的表达,同时能缓解大鼠的脑组织水肿程度,改善神经功能障碍;提高抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,降低促凋亡蛋白Bax、Cleaved Caspase-3的表达水平;SAH大鼠皮层脑组织中的TUNEL阳性细胞数量也显著下降;另外,使用咯利普兰抑制PDE4后,可观察到SIRT1和p-Akt的表达水平显著升高。第三部分1.使用SIRT1特异性抑制剂sirtinol预处理会阻断PDE4抑制剂咯利普兰对SAH大鼠的神经保护作用。显著加重脑水肿程度和神经功能障碍,显著降低抗凋亡蛋白Bcl-2表达水平,显著提升促凋亡蛋白Bax、Cleaved Caspase-3表达水平;显著增加SAH大鼠脑组织中TUNEL阳性细胞数量;同时显著抑制Akt的磷酸化。2.使用Akt抑制剂MK2206处理会阻断PDE4抑制剂咯利普兰对SAH大鼠的神经保护作用。显著加重脑水肿程度和神经功能障碍,显著降低抗凋亡蛋白Bcl-2表达水平,显著提升促凋亡蛋白Bax、Cleaved Caspase-3表达水平;显著增加SAH大鼠脑组织中TUNEL阳性细胞的数量;然而对SIRT1的表达无明显影响。结论1.在蛛网膜下腔出血的SD大鼠脑组织中,磷酸二酯酶-4(PDE4)主要表达分布在神经元细胞中,少量分布于小胶质细胞及星形胶质细胞;早期脑损伤发生后,磷酸二酯酶-4(PDE4)及SIRT1/Akt通路相关蛋白表达显著改变,提示磷酸二酯酶-4(PDE4)及SIRT1/Akt通路可能参与了蛛网膜下腔出血后早期脑损伤的病理过程。2.使用咯利普兰抑制磷酸二酯酶-4(PDE4)可显著缓解蛛网膜下腔出血SD大鼠的脑组织水肿,减轻神经细胞的凋亡,改善其神经功能障碍;可提高SIRT1和p-Akt的表达水平。3.SIRT1特异性抑制剂sirtinol和Akt抑制剂MK2206可显著阻断咯利普兰的抗凋亡和改善神经功能障碍的作用,同时sirtinol可抑制Akt的磷酸化水平,MK2206不影响SIRT1的表达。以上结果提示利用咯利普兰抑制磷酸二酯酶-4(PDE4)后,可通过激活SIRT1/Akt信号通路来发挥神经保护作用。(图4)