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目的:肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)在全球癌症相关死亡率的排名中位列第三位。肝细胞癌晚期易出现转移、复发及临床耐药且预后相对较差。尽管通过手术、放疗、化疗等手段在一定程度上能延缓疾病进展,但大多数患者随着病情发展仍不能避免转移及复发。因此,阐明肝细胞癌发生发展过程,明确其分子调节机制,探索肝细胞癌治疗的针对性靶点具有极其重大的意义。长链非编码RNA NEAT1(Nuclear enriched abundant transcript 1)被认为是一种新型的功能性非编码RNA,是一组长度大于200个核苷酸的非编码RNA,在肿瘤细胞物质循环、能量摄取及代谢重编程等诸多过程中发挥不可替代的调控作用。但NEAT1调控肝癌细胞生命活动过程中的具体机制尚不明确。自噬是应激条件下细胞自我保护的重要方式,自噬水平适当提高有助于肿瘤细胞的生长及耐药。本研究旨在探索NEAT1调控肝癌细胞自噬的机制及其对抗肿瘤药物抵抗能力的影响,致力于提供更多的理论基础来丰富肝细胞癌的发病机制和治疗策略。研究方法:1、通过TCGA(The Cancer Genome Atlas)数据库对癌症组织和癌旁组织中NEAT1的表达情况进行比对,并进行生存分析。PCR实验对肝癌细胞系和L02细胞系进行NEAT1表达比对。2、构建NEAT1过表达肝癌细胞系(HepG2和Huh7),通过qRT-PCR(Polymerase chain reaction)进行转染后表达的测定,通过CCK8实验、划痕实验及平板集落形成实验评估索拉菲尼处理后NEAT1过表达细胞系与对照组生长和迁移能力的差异。3、通过Western Blot实验、免疫荧光实验及透射电镜对自噬的过程及自噬相关基因进行相关表达的检测。4、Western blot实验检测AKT/mTOR信号。5、荧光原位杂交实验(Fluorescence in situ hybridization,FISH)观测NEAT1的亚细胞定位。6、通过TCGA数据库分析多种自噬相关基因(Autophagy-related genes,ATGs)在癌症组织和癌旁组织中的表达差异。构建NEAT1过表达细胞系,Western blot实验检测ATG3在阴性对照组和NEAT1过表达组表达情况并进行比对。7、TCGA数据库分析ATG3负相关miRNA,并通过生物信息学网站分析分子间结合可能性,构建miR-204过表达细胞系,PCR及Western blot实验检测ATG3 mRNA和蛋白表达,并通过双荧光素酶报告基因实验检测miR-204与ATG3 mRNA的结合。8、通过Western blot实验、双荧光素酶基因报告实验、RIP(RNA immunoprecipitation)及RNA pull down实验证明分子间的结合及调控关系。结果:1、TCGA数据库分析发现肝细胞癌组织中NEAT1表达水平与癌旁组织相比呈现增高趋势(P<0.05),NEAT1的表达与HCC患者的生存率呈负相关(P<0.01),细胞系检测发现肝癌细胞中NEAT1的表达水平较对照组相比呈现更高趋势,差异具有统计学意义(P<0.05)。2、过表达NEAT1可减弱索拉菲尼的抑制作用(生长、迁移和集落形成),差异具有统计学意义(P<0.05)。3、过表达NEAT1激活HCC相关细胞系的细胞自噬,差异具有统计学意义(P<0.05)。4、NEAT1可促进AKT/mTOR信号活化。5、原位杂交实验分析发现NEAT1主要在胞质分布。6、TCGA数据结果提示癌症组织与癌旁组织中ATG3表达差异量最大(P<0.01),ATG3高表达与预后不良相关(P<0.001),过表达NEAT1后ATG3蛋白表达水平及mRNA表达水平增高(P<0.05)。7、根据TCGA数据库临床数据分析及生物信息学网站预测提示ATG3与miR-204结合可能性最高、相关性最强,细胞学实验证明miR-204过表达后ATG3表达水平减少。双荧光素酶基因报告实验证明了miR-204与ATG3之间可能存在结合位点(P<0.05)。8、过表达NEAT1抑制mi R-204表达(P<0.05),双荧光素酶基因报告实验、RIP实验及RNA pull down实验证明了NEAT1与miR-204、miR-204与ATG3 mRNA存在结合位点,差异具有统计学意义(P<0.05)。Western blot实验证明了NEAT1能通过miR-204调控ATG3表达。结论:过表达NEAT1能增加肝癌细胞对索拉菲尼的抵抗能力(生长、迁移),提示其是一个促癌基因并可能参与肝癌细胞对索拉菲尼的耐药过程。NEAT1能靶向结合miR-204从而恢复ATG3的表达水平,进而促进肝癌细胞自噬。因此,NEAT1有望成为一个新型分子药物靶点。