白细胞介素24(IL-24,Interleukin-24),原名黑色素瘤分化相关抗原7(melanoma differentiation-associated antigen-7, MDA-7)[1],主要由CD3+T淋巴细胞和单核细胞表达,为分泌型蛋白,属于IL-10家族成员。研究显示,IL-24是一种既具有抑制肿瘤细胞生长和血管形成,又能刺激免疫细胞表达细胞因子的抑癌基因,而且对正常细胞几乎无影响。同时,IL-24还具有增强肿瘤细胞对放疗的敏感性和协同化疗药抗肿瘤的特性。对肿瘤的治疗有重要的研究和应用价值。大量实验已证明,IL-24基因可以有效的抑制肿瘤细胞的生长,如胃癌、肝癌等,但其关于皮肤鳞癌细胞的研究未见报道。皮肤鳞状细胞癌(cutaneous squamous cell carcinoma, CSCC,简称鳞癌),是最常见的一种皮肤肿瘤,大约占非黑素皮肤肿瘤的20%,而非黑素皮肤肿瘤大约占所有皮肤肿瘤的96%,发生转移的风险为2-3%。除了使用防晒霜等进行预防和通过外科手术切除肿瘤皮损,基因治疗可能成为治疗皮肤鳞最重要的措施和途径。本课题利用已成功构建的腺病毒介导IL-24基因表达载体--Ad-IL-24,使皮肤鳞癌细胞过表达IL-24蛋白,以皮肤鳞癌COLO-16细胞系细胞,及SCL-1细胞系细胞为目的细胞,观察IL-24对其生长和凋亡的影响及其机制,为皮肤鳞癌的基因治疗提供实验室依据。本实验共分为四部分第一部分IL-24过表达的皮肤鳞癌细胞模型的建立目的建立可以过表达IL-24的皮肤鳞癌细胞模型方法利用腺病毒载体介导的Ad-IL-24感染皮肤鳞癌细胞,并用QPCR法检测IL-24基因在皮肤鳞癌细胞系COLO-16细胞,及SCL-1细胞中的表达1.腺病毒的构建(1)腺病毒制备(2)腺病毒包装、收集(3)病毒的纯化2.感染目的细胞的选择及培养本实验使用的目的细胞为皮肤鳞癌细胞系COLO-16细胞和SCL-1细胞。3.感染细胞最佳MOI的选择以COLO-16细胞作为筛选细胞,选择感染细胞的最佳MOI4.QPCR法检测IL-24基因在皮肤鳞癌细胞COLO-16,及SCL-1中的表达实验分Ad-IL-24组、Ad-GFP组和空白组3组。用37℃、5%C02的培养箱培养72 h后,收集COLO-16细胞、SCL-1细胞,提取细胞总RNA,逆转录生成cDNA,进行real-time PCR反应。结果：Ad-IL-24组的COLO-16细胞及SCL-1细胞中IL-24基因的表达水平均较相对应的Ad-GFP组以及空白组明显上升(P<0.05)。结论：成功建立IL-24过表达的皮肤鳞癌细胞模型第二部分Ad-IL-24对COLO-16细胞及SCL-1细胞增殖的影响目的 研究IL-24对皮肤鳞癌细胞增殖的影响,为IL-24的抗皮肤鳞癌提供依据方法 MTT法检测细胞增殖率细胞被接种在96孔板,并分三组：①Ad-IL-24组,②Ad-GFP组,③空白组。分别在第0、1、2、3、4、5、6天时加入预先配制的MTT溶液(5mg/ml),10ul/孔,设3个复孔,在培养箱中孵育4h,加入150ul溶解剂DMSO,在微量震荡仪上适度震荡8min,通过酶标仪免疫检测仪测量OD值(490)。绘制生长曲线。结果COLO-16细胞：在第1-3天间,三组间的细胞增值无显著差异；从第4天开始,Ad-IL-24组的细胞增殖显著低于Ad-GFP组和空白空白组(P<0.05),第6天差异最大,并在4天后Ad-IL-24组细胞呈现时间依赖性抑制；而Ad-GFP组与空白组间的差异无统计学意义(P>0.05)。SCL-1细胞：在第1-3天间,三组间的细胞增值无显著差异；从第4天开始,Ad-IL-24组的细胞增殖显著低于Ad-GFP组和空白空白组(P<0.05),第6天差异最大；而Ad-GFP组与空白组间的差异无统计学意义(P>0.05)。结论：IL-24可明显抑制皮肤鳞癌细胞系COLO-16细胞及SCL-1细胞的增值第三部分Ad-IL-24对COLO-16细胞及SCL-1细胞凋亡的影响目的 研究IL-24对皮肤鳞癌细胞的影响,为IL-24的抗皮肤鳞癌提供依据方法以皮肤鳞癌细胞COLO-16细胞及SCL-1细胞为研究对象1.利用激光共聚焦观察细胞形态实验分Ad-IL-24组、Ad-GFP组和空白组3组。用37℃、5%CO2的培养箱培养72h后,(1)PI染色：培养72 h后,收集细胞悬液,PBS洗涤3次,4%甲醛固定,按照FITC-Annexin V细胞凋亡检测试剂盒说明操作,每孔加入binding buffer 100ul和 Annexin V 2ul,室温下孵育10min; (2) DAPI染色：细胞培养72 h后,将一定浓度的DAPI加入培养基中与细胞共同孵育过夜,再用PBS缓冲液漂洗6次。在激光扫描共聚焦显微镜下观察细胞凋亡的形态改变以检测细胞的早期和晚期凋亡。2.流式细胞技术实验分Ad-IL-24组、Ad-GFP组和空白组3组。用37℃、5%C02的培养箱培养72 h后收集细胞悬液培养72 h后,收集细胞悬液,PB洗涤3次,70%冷乙醇固定后,加入PI等试剂,流式细胞仪检测细胞凋亡变化。结果：1.激光共聚焦结果COLO-16细胞：感染Ad-IL-24病毒的COLO-16细胞,72h后可出现明显的细胞毒性,细胞变圆,聚集成团,而且部分细胞漂浮,数量明显减少,Ad-GFP组和空白组的COLO-16细胞呈贴壁生长,状态良好,形态完整。分别对空白组、Ad-GFP. Ad-IL-24组的COLO-16细胞行DAPI染色及PI染色后,在激光共聚焦显微镜下观察到Ad-IL-24组的COLO-16细胞有明显的早期凋亡信号并出现细胞体积缩小、核浓缩、边集、碎裂并形成凋亡小体,而空白组和Ad-GFP处理的COLO-16细胞的细胞核均呈弥散均匀的荧光。SCL-1细胞：感染Ad-IL-24病毒的SCL-1细胞,72h后可出现明显的细胞毒性,细胞变圆,聚集成团,而且部分细胞漂浮,数量明显减少,Ad-GFP组和空白组的SCL-1细胞呈贴壁生长,状态良好,形态完整。分别对空白组、Ad-GFP、 Ad-IL-24组的SCL-1细胞行DAPI染色及PI染色后,在激光共聚焦显微镜下观察到Ad-IL-24组的COLO-16细胞有明显的早期凋亡信号并出现细胞体积缩小、核浓缩、边集、碎裂并形成凋亡小体,而空白组和Ad-GFP处理的SCL-1细胞的细胞核均呈弥散均匀的荧光。2.流式细胞仪结果COLO-16细胞：Ad-IL-24组的COLO-16细胞凋亡率为(13.1±O.92)%,显著高于空白组的凋亡率(3.69±O.36)%(P<0.05)和Ad-GFP组的凋亡率(3.39±1.06)%(P<0.05),而后两组间的差异无统计学意义(P>0.05)。虽然Ad-IL-24组的细胞早期凋亡与空白组和Ad-GFP组有一定差异,而晚期凋亡更明显。SCL-1细胞：经流式细胞仪检测发现Ad-IL-24蛋白组的SCL-1细胞凋亡率为(18.6±1.25)%,显著高于空白组的凋亡率(3.81±0.46)%(P<0.05)和Ad-GFP组的凋亡率(6.07±0.97)%(P<0.05),而空白组和Ad-GFP组之间无明显差异(P>0.05)。结论：IL-24可以诱导皮肤鳞癌系COLO-16以及SCL-1细胞的凋亡。第四部分IL-24对COLO-16、SCL-1细胞中凋亡marker:Bax、Bcl-2、 caspase-3表达的影响目的通过检测COLO-16、SCL-1细胞中的凋亡marker:Bcl-2、Bax、caspase-3的表达,探讨IL-24对鳞癌细胞COLO-16细胞以及SCL-1细胞促凋亡的机制方法分别通过Western blotting法、QPCR法以及免疫荧光方法检测皮肤鳞癌细胞COLO-16、SCL-1中凋亡narker:Bax、Bcl-2 及 cleaved caspase-3的表达,从而进一步探讨IL-24的抗肿瘤的机制。1.Western blotting检测皮肤鳞癌细胞COLO-16和SCL-1中凋亡marker:Bax、 Bcl-2 及 cleaved caspase-3的表达实验分Ad-IL-24组、Ad-GFP组和空白组3组。用37℃、5%C02的培养箱培养72 h后,收集细胞,加细胞裂解液充分裂解并取总蛋白上清,进行SDS-PAGE (聚丙烯凝胶电泳)；再将凝胶蛋白转移到硝酸纤维膜,在37℃条件下用5%的脱脂奶粉封闭1小时；加入兔抗人Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3,37℃孵育1 h,TBST洗涤；加山羊抗兔IgG二抗,37℃条件下孵育1小时,TBST洗涤后将NC膜与发光工作液接触充分,室温孵育3 rain,在暗室内进行压片、曝光、显影和定影步骤。2.QPCR法检测皮肤鳞癌细胞COLO-16和SCL-1中凋亡marker:Bax、Bcl-2的表达实验分Ad-IL-24组、Ad-GFP组和空白组3组。在37℃、5%C02条件下培养72 h,收集COLO-16细胞、SCL-1细胞,PBS洗涤3次后,提取细胞总RNA,提取细胞总RNA,并逆转录生成cDNA,进行real-time PCR反应。3.免疫荧光方法检测IL-24过表达后COLO-16细胞和SCL-1细胞中的凋亡marker:Bax, Bcl2的表达实验分Ad-IL-24组、Ad-GFP组和空白组3组。在37℃、5%C02条件下培养72 h,PBS洗涤3次,用4%多聚甲醛固定10min,再经过透化液处理30min后,加入兔抗人Bax、Bcl-2,4℃条件下孵育过夜,PBS洗涤；再加山羊抗兔IgG二抗,室温孵育1 h,封片,观察显微镜。结果1.COLO-16细胞：其中Western blotting结果可见：Ad-IL-24组的条带中出现了相对分子质量为17000和19000的条带,以及与抗cleaved caspase-3抗体结合的特异性条带,而在对应的位置上,空白组和Ad-GFP组则均未出现上述条带。同时Ad-IL-24组的Bax的蛋白水平相对于空白组和Ad--GFP组出现了明显的上升,Bcl-2的蛋白水平相对于空白组和Ad-GFP组出现了明显下降。QPCR检测Bax.Bcl-2的mRNA表达水平,发现Ad-IL-24组的BaxmRNA水平上升,Bcl-2mRN A水平下降。免疫荧光结果显示,细胞中的IL-24过表达后,Bax在细胞中的表达明显升高,而Bcl-2在细胞中的表达却明显下降。2.SCL-1细胞：其中Western blotting结果可见：Ad-IL-24组的条带中出现了相对分子质量为17000和19000的条带,以及与抗cleaved caspase-3抗体结合的特异性条带,而在对应的位置上,空白组和Ad-GFP组则均未出现上述条带。同时Ad-IL-24组的Bax的蛋白水平相对于空白组和Ad-GFP组出现了明显的上升,Bcl-2的蛋白水平相对于空白组和Ad-GFP组出现了明显下降。QPCR检测Bax、Bcl-2的mRNA表达水平,发现Ad-IL-24组的BaxmRNA水平上升,Bcl-2mRNA水平下降。免疫荧光结果显示,细胞中的IL-24过表达后,Bax在细胞中的表达明显升高,而Bcl-2在细胞中的表达却明显下降。结论：IL-24调控皮肤鳞癌系COLO-16细胞和SCL-1细胞的凋亡,其机制可能与提高Bax/Bcl-2比值、激活easpase-3等级联反应机制有关。总结论：1、本研究利用腺病毒分别感染皮肤鳞癌细胞系COLO-16及SCL-1细胞后,能使COLO-16及SCL-1细胞IL-24基因高表达,为研究IL-24对皮肤鳞癌的作用研究提供了模型。2、从第4天开始,IL-24可明显抑制皮肤鳞癌细胞系COLO-16细胞的增殖,呈时间依赖性。同样,SCL-1细胞也可以从第4天开始明显被抑制。3、IL-24可以诱导皮肤鳞癌系COLO-16以及SCL-1细胞的凋亡。其中IL-24对COLO-16细胞的晚期凋亡影响更明显。4、IL-24调控皮肤鳞癌系COLO-16细胞和SCL-1细胞的凋亡,其机制可能与提高Bax/Bcl-2比值、激活easpase-3等级联反应机制有关。