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目前,心血管疾病在威胁着人类的健康和生命。血管堵塞是心血管疾病的一个典型症状。一旦血管遭遇阻塞,则迫切需要重建血流,以防止下游组织缺血。组织工程血管移植物是重建血流的潜在解决方案。鉴于天然血管的多层特征结构,移植物应该允许腔内内皮细胞（EC）单层的形成,从而模仿内膜。在尝试模仿中膜时,应考虑血管平滑肌细胞（SMC）的堆积和方向。然而目前的小直径血管移植物中,存在着诸如内皮化不足、平滑肌细胞的定殖效果不佳以及不能很好地仿生血管结构等问题。本课题组前期已成功制备出具有双层双取向的小直径组织工程血管移植物。然而还不能很好的模仿天然血管三层特征结构,且促进SMC向支架内部迁移效果不佳。因此,本研究将从两个方面对此进行优化改进,其一是通过多层静电纺丝技术,结合旋转、卷曲和折叠等方法来制备仿生三层双取向管状支架,以仿生天然血管多层特征结构;其二是通过提高纤维直径制备出具有多级孔径结构的大孔径双层双取向管状支架,以更好的促进SMC向支架内部的迁移。具体研究内容如下:将聚己内酯（PCL）、聚乳酸羟基乙酸共聚物（PLGA）和明胶（Gel）按1:1:1比例共混,通过静电纺丝结合旋转、卷曲和折叠等方法制备了三层管状血管支架。分别研究了三层纤维膜的纤维取向、纤维直径、孔径大小以及SMC、EC和成纤维细胞（NIH3T3）在不同层上的生长状态和接触引导效应。结果显示内层和中层纤维均具有高度取向结构,外层纤维为无取向结构。内层和中层取向纤维能引导EC和SMC的取向生长,外层无取向纤维上NIH3T3则为无取向生长状态。该三层支架很好地仿生了天然血管多层特征结构,但其致密的纤维结构不利于细胞的浸润,将导致平滑肌细胞不能更快更好地向支架内部迁移。因此,还需进一步提高中层纤维孔径,以利于SMC更快更好的向支架全层厚度内迁移,从而实现功能重建。基于此,我们进一步通过分步电纺PCL-PEG-PCL（PCE）和PCE/Gel的共混物（PCEG）制备了具有纳米和微米纤维的分级孔径双层支架。纳米和微米纤维的结构特征分别由静电纺丝溶液中PCE的浓度和PCEG的比例来调整。结果表明,18%（w/v）PCE（PCE18）和PCE/Gel（w/w）=7:3（P7G3）时静电纺丝膜具有最佳的纤维形貌和较高的力学性能。体外细胞与膜共培养研究表明,所有PCE膜均能支持内皮细胞的增殖和扩张,并使膜表面进一步内皮化,而PCEG膜则能促进SMC向支架内迁移。综合考虑孔径大小和力学性能,选择PCE18和P7G3分别构建具有分级孔径的双层支架的内层和外层。细胞与该双层支架共培养7天后,发现管腔表面形成了连续的内皮单层,SMC开始从外层定殖,显示了该双层支架在血管重塑和再生方面的巨大潜力。在此基础上,我们进一步引入取向结构,制备了多级孔径双层双取向仿生支架（b PCEG）。SEM结果表明成功制备了内外层垂直取向的双层支架。力学实验显示取向纤维比无取向纤维具有更高的拉伸强度,且该多级孔径双层双取向仿生支架破裂压力和缝合线保持力均高于冠状动脉和隐静脉,具有较高的力学性能,满足体内植入要求。体外细胞实验表明,内外层取向纤维均能引导细胞取向生长,且细胞在膜上的增殖高于孔板上,纤维具有良好生物相容性。细胞和支架共培养中,内层可支持形成内皮单层而外层支持平滑肌细胞浸润并引导其周向排列。体外动态培养1、2个月后,HE染色显示了支架中含有大量的胶原纤维,说明形成了类天然ECM结构。在支架原位替换兔颈动脉实验中,支架植入一个月后发现大量细胞长入内部。这些结果均表明该多级孔径双层双取向支架在小直径血管组织工程的修复和再生中有很好的应用前景。