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研究背景:肝细胞肝癌（简称肝癌,HCC）相关死亡占肿瘤相关死亡的第三位,根据流行病学研究发现,由于致病因子和人口结构等因素改变,目前全世界肝癌发病人数正在不断上升。早期肝癌主要通过手术切除,然而术后大约～75%的患者在5年内出现复发转移。同时大部分患者在肝癌进展期才被发现,因此肝癌总体预后没有获得明显改善。因此探究肝癌转移机制,寻找肝癌潜在干预方式至关重要。变异或功能异常的转录因子通过调节基因异常表达促进肿瘤发生发展。同源异型盒基因（Sine oculis homeobox,SIX）属于同源盒（homeobox）超家族,编码六个转录因子,拥有进化保守的同源结构域和SIX结构域。SIX家族成员在胚胎重塑和组织器官发育中发挥重要作用。目前,一系列研究表明SIX家族成员在肿瘤发生发展以及复发转移过程中扮演着不同的角色。如SIX1和SIX2发挥癌基因作用,促进肿瘤进展;相反SIX3抑制肿瘤增殖转移。然而SIX家族在肝癌中的系统作用还缺乏深入了解,值得进一步研究。研究目的:1:分析SIX家族成员在肝癌中表达情况,探究SIX4在肝癌转移中的作用。2:阐明SIX4促进肝癌转移的分子机制。3:探究SIX4在肝癌中异常表达的上游分子机制。4:寻找SIX4相关肝癌的潜在干预措施。研究方法:1.应用RT-qPCR分析SIX家族成员在肝脏正常组织、癌旁和肝癌组织中的表达,筛选出上调最显著的SIX4基因用于下一步研究。分析SIX4基因在正常肝组织以及50对癌旁和肝癌组织中的表达。运用免疫组化检测SIX4在癌旁、肝癌和肝癌转移灶中的表达,免疫组化芯片检测SIX4在癌旁和肝癌组织中的表达。构建敲低和过表达SIX4的稳定肝癌细胞系,通过一系列体内外实验证明SIX4促进肝癌转移。2.运用肝癌相关PCR芯片筛选SIX4过表达后的差异分子,运用截短突变、双荧光素酶报告基因以及染色质免疫共沉淀（chromatin immunoprecipitation,Ch IP）等方法验证SIX4的下游靶基因YAP1和Met。Western blotting检测细胞核内YAP1以及c-MET靶基因表达情况。构建稳转肝癌细胞系,运用一系列体内外实验探究YAP1和c-MET在SIX4促进肝癌转移中的作用。3.用肝细胞生长因子（HGF）处理PLC/PRF/5细胞,检测SIX4在m RNA和蛋白水平的变化。运用截短突变和双荧光素酶报告基因寻找与SIX4启动子区域相互结合的转录因子。用ERK、JNK、P38和PI3K信号通路抑制剂处理PLC/PRF/5细胞,探究HGF诱导SIX4表达的具体信号通路。构建PLC/PRF/5-HGF稳转细胞系,通过体内外实验探究SIX4在HGF介导的肝癌转移中的作用。4.通过体内外实验探究YAP1抑制剂维替泊芬（Verteporfin,VP）和c-MET抑制剂Capmatinib在治疗SIX4高表达肝癌中的潜在应用价值。结果:1.通过RT-qPCR发现SIX家族成员中,SIX4上调最为显著。与无复发和转移的组织相比,复发和转移的标本中SIX4的m RNA水平明显增加。IHC染色结果显示SIX4主要分布在细胞核中,并且在转移的肝癌组织中显著上调。临床资料表明,SIX4高表达与肝癌患者的TNM分期密切相关。Transwell实验证明过表达SIX4显著增加PLC/PRF/5细胞的运动能力,相反下调SIX4表达明显抑制MHCC97H细胞的运动能力。通过裸鼠肝脏原位种植模型发现,SIX4上调增加肝癌肺脏转移发生率和肺转移结节数目,缩短总生存率,相反下调SIX4的表达显著降低裸鼠肝癌肺脏转移发生率和肺转移结节数目,改善小鼠生存时间。2.运用肝癌PCR芯片发现过表达SIX4可显著上调一系列与肝癌转移密切相关分子的表达,如MET,YAP1,TLR4,EGFR,HGF,MYC,CTNNB1,CXCR4和ADAM17等,在这些上调的分子中,MET和YAP1上调最明显。运用RT-qPCR及Western blotting检测发现,在PLC/PRF/5细胞中上调SIX4显著增加c-MET和YAP1的表达,在MHCC97H细胞中敲低SIX4的表达显著降低c-MET和YAP1的表达水平。根据预测发现SIX4在YAP1基因的启动子区域有2个潜在结合位点,通过双荧光素酶报告基因和Ch IP实验发现,SIX4直接结合YAP1启动子区域,且SIX4主要通过第一个结合位点转录激活YAP1。相似的,SIX4在MET基因的启动子区域有2个潜在的结合位点,SIX4直接结合MET的启动子区域,SIX4主要通过第一个结合位点转录激活MET。通过Western blotting进一步发现,SIX4上调增加YAP1在细胞核里的表达量,促进c-MET磷酸化和下游靶基因激活,敲低SIX4则呈现相反效应。通过体内外研究表明,下调YAP1和c-MET的表达明显抑制SIX4诱导的肝癌迁移侵袭和转移;然而上调YAP1和c-MET的表达在一定程度上逆转SIX4下调引起的肝癌迁移侵袭和转移的降低。在肝癌标本中,SIX4的表达与YAP1和c-MET的表达呈现显著正相关性。3.HGF重组蛋白处理PLC/PRF/5细胞24小时后,RT-qPCR及Western blotting发现HGF可以显著促进SIX4的表达。对SIX4基因的启动子区域进行截短和突变实验发现,HGF激活NF-kB通路,促进SIX4转录激活。用HGF/c-MET下游信号通路抑制剂预处理PLC/PRF/5细胞后发现,ERK通路抑制剂能逆转HGF诱导的SIX4表达。在肝癌临床标本中,SIX4的表达与HGF的表达呈现明显正相关性。通过体内外实验表明,HGF促进肝癌迁移侵袭和转移。构建PLC/PRF/5-HGF稳定细胞系,在该细胞中下调SIX4的表达,体内外实验证明下调SIX4显著抑制PLC/PRF/5-HGF细胞的运动和转移能力;4运用YAP1抑制剂VP和c-MET抑制剂Capmatinib分别或联合处理PLC/PRF/5-SIX4细胞后发现,两药联合运用可以显著降低PLC/PRF/5-SIX4细胞的运动能力。在裸鼠肝脏原位种植PLC/PRF/5-SIX4细胞后,分别给予对照,VP,Capmatinib或者VP联合Capmatinib。根据结果发现单一用药部分逆转SIX4促进的肝癌转移,然而两药联合处理后显著削弱SIX4介导的肝癌转移,明显延长小鼠生存时间。结论本研究发现SIX4在肝癌组织中高表达,SIX4能促进肝癌转移;SIX4转录激活YAP1和MET,促进肝癌转移;阐明了HGF通过c-MET/ERK/NF-kB信号通路上调SIX4的表达,SIX4对HGF促进的肝癌转移至关重要;YAP1抑制剂VP和c-MET抑制剂Capmatinib联合运用显著抑制SIX4诱导的肝癌转移。综上所诉,本研究详细阐明了SIX4促进肝癌转移的具体分子机制,探索了该类型肝癌潜在的治疗策略,为肝癌治疗提供一定的参考。